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三株异养硝化细菌的分离、特征及其对水产养殖废水脱氮作用研究

作　者: 赵诣
导　师: 闵航
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 氨氮 亚硝态氮 硝态氮 菌株ZY-1,ZY-2,ZY-3 工程菌株ZY-4 生物脱氮 水产养殖废水
分类号: X703
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


氮元素是水产养殖水体中较常见的一种限制初级生产力的营养元素,对水产养殖影响巨大。养殖水体中积累的氨氮和硝态氮 的学位论文">亚硝态氮对水产养殖生物可造成巨大危害,其影响不容忽视。本论文围绕水产养殖废水生物脱氮这一主题,对异养硝化微生物的分离及其脱氮性能、亚硝酸还原酶基因的克隆及其工程菌构建等多个方面展开了研究,结果分述如下:（1）异养硝化菌的分离及其氨氮去除能力的测定从杭州四堡污水处理厂活性污泥中筛选得到3株异养硝化菌株。菌株ZY-1、ZY-2、ZY-3分别鉴定为弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）、蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。3株异养硝化菌对氨氮和总氮都有较好的去除能力,且在去除过程中只有少量氧化氮积累,具有进一步研究利用的价值。（2）三株异养硝化菌的脱氮特性研究菌株ZY-1、ZY-2和ZY-3在好氧条件下对亚硝态氮具有非常好的去除效率,48 h内基本能将65 mg/L的亚硝态氮完全去除,对总氮的去除率也分别达到84.83%、83.42%和92.22%。将3株菌接入含有硝态氮的培养基中进行厌氧培养,结果显示,菌株ZY-1、ZY-2和ZY-3具有较强的反硝化能力,72 h内的硝态氮去除率分别为99.42%,99.31%和96.26%。结合3株菌对3种不同形式的氮的去除能力,推测菌株ZY-1、ZY-2和ZY-3具有同步硝化-反硝化能力,其脱氮途径为:NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2。菌株ZY-1在好氧条件下的氨氮去除能力稍逊于其他2株异养硝化细菌。对其脱氮条件包括培养基起始pH、接种量、摇床转速、培养温度等优化后,菌株ZY-1生长能力和脱氮能力都得到了大幅度提高。（3）亚硝酸还原酶基因脱氮工程菌的构建及应用利用生物工程手段,将菌株ZY-3内的亚硝酸还原酶编码基因（nirS）转移至E.coli BL 21中并成功进行了表达,构建了工程菌株pET-28a-nirS-E.coli BL 21ZY-4。该菌对模拟及实际水产养殖废水中的亚硝态氮具有较好的去除能力,并且能利用氨氮作为氮源,将水体内的氨氮同化去除。工程菌株与异养硝化菌株ZY-1及ZY-2组成的混合菌群对于模拟的和实际水产养殖废水均具有很好的处理效果,对氨氮和亚硝态氮的去除效率较高,在实际的养殖废水处理中有一定的应用前景。

全文目录


摘要  11-13
Abstract  13-15
附录清单  15-16
第一章 文献综述  16-30
  1.1 水产养殖水体中的氮及其影响  16-17
    1.1.1 氮元素在水产养殖水体中的存在形式  16
    1.1.2 水产养殖水体中氮的来源  16
    1.1.3 氮元素对水产养殖的影响  16-17
  1.2 生物脱氮的原理及其研究进展  17-21
    1.2.1 传统的生物脱氮  18-19
      1.2.1.1 传统的生物脱氮流程  18-19
      1.2.1.2 传统生物脱氮流程中存在的问题  19
    1.2.2 新型生物脱氮工艺  19-21
  1.3 异养硝化细菌及其研究现状  21-28
    1.3.1 常见的异养硝化微生物  21-22
    1.3.2 异养硝化微生物在生物脱氮中的优势  22
    1.3.3 异养硝化与好氧反硝化的偶联机理及其主要功能酶  22-28
      1.3.3.1 氨加氧酶与羟胺氧化酶  24-26
      1.3.3.2 硝酸盐还原酶  26-27
      1.3.3.3 亚硝酸还原酶  27-28
  1.4 研究的目的、意义及主要内容  28-30
    1.4.1 研究的目的和意义  28-29
    1.4.2 研究的主要内容  29-30
第二章 异养硝化细菌的分离及其氨氮去除能力的测定  30-39
  引言  30
  2.1 材料与方法  30-33
    2.1.1 分离源  30
    2.1.2 培养基及试剂  30-31
    2.1.3 异养硝化菌株的筛选与鉴定  31-32
      2.1.3.1 异养硝化菌株的筛选  31
      2.1.3.2 异养硝化菌株的鉴定  31-32
    2.1.4 分离菌株的氨氧化能力研究  32
    2.1.5 分析方法  32-33
    2.1.6 主要仪器  33
  2.2 结果与分析  33-38
    2.2.1 分离菌株的形态学观察与分析  33
    2.2.2 菌株的生理生化鉴定  33-34
    2.2.3 抗生素抗性实验  34
    2.2.4 分离菌株16s rRNA的序列测定与系统发育分析  34-35
    2.2.5 三株异养硝化菌株的氨氮去除特性初步研究  35-38
  2.3 本章小节  38-39
第三章 三株异养硝化菌的脱氮特性研究  39-50
  引言  39
  3.1 材料与方法  39-41
    3.1.1 培养基  39
    3.1.2 三株异养硝化菌株对硝态氮 的学位论文">亚硝态氮和硝态氮的处理效果  39-40
      3.1.2.1 三株异养硝化菌株好氧条件下亚硝态氮去除能力测定  39-40
      3.1.2.2 三株异养硝化菌株厌氧条件下的反硝化能力测定  40
    3.1.3 菌株ZY-1去除氨氮的条件优化  40-41
      3.1.3.1 培养基起始pH值对菌株ZY-1氨氮去除的影响  40
      3.1.3.2 接种量对菌株ZY-1氨氮去除的影响  40-41
      3.1.3.3 摇床转速对菌株ZY-1氨氮去除的影响  41
      3.1.3.4 培养基温度对菌株ZY-1氨氮去除的影响  41
    3.1.4 分析方法  41
    3.1.5 主要仪器  41
  3.2 结果与讨论  41-49
    3.2.1 三株异养硝化菌株对亚硝态氮和硝态氮的处理效果  41-46
      3.2.1.1 三株异养硝化菌株好氧条件下亚硝态氮去除能力  41-43
      3.1.1.2 三株异养硝化菌株厌氧条件下的反硝化能力  43-46
    3.2.2 菌株ZY-1去除氨氮的条件优化  46-49
      3.2.2.1 培养基起始pH值对菌株ZY-1氨氮去除的影响  46
      3.2.2.2 接种量对菌株ZY-1氨氮去除的影响  46-47
      3.2.2.3 摇床转速对菌株ZY-1氨氮去除的影响  47
      3.2.2.4 培养基温度对菌株ZY-1氨氮去除的影响  47-48
      3.2.2.5 菌株ZY-1培养条件优化后氨氮去除能力对比  48-49
  3.3 本章小结  49-50
第四章 亚硝酸还原酶脱氮工程菌的构建及其应用  50-65
  引言  50
  4.1 材料与方法  50-56
    4.1.1 材料  50-51
      4.1.1.1 菌株  50
      4.1.1.2 质粒  50
      4.1.1.3 试剂盒  50-51
      4.1.1.4 连接酶、内切酶及标准蛋白Marker  51
      4.1.1.5 主要化学试剂及培养基  51
    4.1.2 方法  51-56
      4.1.2.1 引物设计及合成  51-52
      4.1.2.2 基因组DNA的提取  52
      4.1.2.3 PCR扩增  52
      4.1.2.4 连接  52
      4.1.2.5 感受态细胞的制备与转化  52-53
      4.1.2.6 重组质粒的提取与酶切鉴定  53
      4.1.2.7 核酸序列的测定和分析  53
      4.1.2.8 表达载体pET-28α(+)的双酶切  53
      4.1.2.9 连接  53
      4.1.2.10 感受态细胞的制备与转化  53-54
      4.1.2.11 重组质粒的鉴定  54
      4.1.2.12 目的基因在E.coli中的诱导表达  54
      4.1.2.13 重组菌株蛋白的SDS-PAGE  54
      4.1.2.14 工程菌的亚硝氮去除能力测定  54-55
      4.1.2.15 工程菌对实际水产养殖废水及模拟水产养殖废水的处理效果  55
      4.1.2.16 工程菌及两株异养硝化细菌构成的混合菌群对实际水产养殖废水及模拟水产养殖废水的处理效果  55-56
  4.2 结果与分析  56-64
    4.2.1 PCR扩增和测序结果  56
    4.2.2 基因克隆  56-57
    4.2.3 基因表达  57
    4.2.4 重组菌株的全细胞蛋白电泳检测  57-58
    4.2.5 工程菌株ZY-4的亚硝氮去除能力  58-61
    4.2.6 工程菌株ZY-4对模拟水产养殖废水及实际水产养殖废水的处理效果  61-62
    4.2.7 工程菌株ZY-4、异养硝化菌株ZY-1和ZY-2组成的混合菌群对模拟水产养殖废水及实际水产养殖废水的处理效果  62-64
  4.3 本章小节  64-65
第五章 论文总结  65-68
  5.1 论文的主要研究结论  65-66
  5.2 论文的创新之处  66
  5.3 论文的不足与展望  66-68
参考文献  68-73
附录 1  73-75
附录 2  75-76
攻读硕士学位期间论文撰写与发表情况  76-77
致谢  77

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 废物处理与综合利用 > 一般性问题 > 废水的处理与利用
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