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茶树多酚氧化酶的基因克隆与原核表达

作　者: 刘敬卫
导　师: 黄友谊；倪德江
学　校: 华中农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶树多酚氧化酶基因克隆原核表达包涵体纯化酶活性测定
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO,EC.1.10.3.1)对茶叶品质的形成起关键作用,尤其与红茶品质的形成更是密切相关。茶树PPO除可应用于提高红茶品质外,还可应用于制备茶黄素及酚类废水治理等方面的研究。本课题选用国家级茶树良种宜红早和地方优良茶树品种安徽一号为材料,以鲜叶基因组DNA为模板,克隆了茶树PPO基因,并进行原核表达,最终获得了具有生物活性的茶树PPO工程蛋白,为应用于红茶加工以及茶黄素生物制剂的研发等方面提供了理论基础。研究结果如下:(1)茶树多酚氧化酶的基因克隆与生物信息学分析直接以宜红早和安徽一号的基因组DNA为模板,扩增PPO基因,将获得的PPO基因测序,并对其基因和蛋白质序列进行了生物信息学分析,结果表明安徽一号和宜红早的PPO基因序列与GenBank中已公布的其它茶树品种的PPO基因高度同源,尤其是在铜离子结合部位。茶树PPO为细胞质中合成的亲水性不稳定蛋白,不存在跨膜螺旋,没有信号肽,但是含有叶绿体转移肽,协助PPO定位于叶绿体中。在此基础上,对PPO蛋白的二级结构进行了分析,并成功构建了其三维结构模型。所获得的基因序列已在GenBank中登陆注册,登陆号为EU787433(宜红早1800bp)、FJ210643(安徽一号1800 bp)、FJ210644(安徽一号1799 bp)、FJ210645(安徽一号1803 bp)。(2)茶树多酚氧化酶的原核表达与酶活力测定尝试了pET20bn、pET28a、pET32a和pET20b四种蛋白表达载体表达茶树PPO,结果发现表达载体的种类与PPO的表达量有明显的相关性。以pET28a和pET20b为载体不表达;pET20bn虽能表达PPO,但表达量偏低;以pET32a为表达载体,PPO能大量表达,尽管极易形成包涵体,但依然有小量可溶性蛋白。因此,最终选择pET32a作为茶树PPO的表达载体。可能由于安徽一号PPO基因在扩增过程中产生了突变,致使其在大肠杆菌中没能表达,因此我们在本试验中只对宜红早PPO基因大量表达,以镍离子亲和柱纯化可溶性的部分,经SDS-PAGE电泳检测,发现除目的蛋白外,还含有较明显的两条杂蛋白。将所得PPO工程蛋白进行酶活性检测,活力可达20.867U。(3)茶树多酚氧化酶亚蛋白的原核表达以纯化的安徽一号(FJ210643)和宜红早(EU787433)PPO基因为模板,对PPO亚蛋白的基因序列进行了扩增,分别为PPO-1532bp和PPO-1053bp。原核表达SDS-PAGE电泳检测的结果表明,与PPO全长基因相比,亚蛋白基因更容易在大肠杆菌中表达,说明导肽对蛋白表达量有显著影响。对PPO亚蛋白粗酶液酶活性进行测定,发现切去导肽后的亚蛋白粗酶液活性高于全长蛋白粗酶液,因此可用于大量纯化和制备PPO亚蛋白。(4)茶树多酚氧化酶包涵体的变性与复性大量表达获得宜红早PPO、宜红早PPO-1532和安徽一号PPO-1532的包涵体蛋白,采取变性后超滤复性,SDS-PAGE电泳结果表明,可得到电泳纯的PPO蛋白和亚蛋白,但蛋白复性率较低。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词  10-11
第1章文献综述  11-22
  1 茶树多酚氧化酶的生化性质研究  11-13
    1.1 多酚氧化酶的酶学分类研究  11-12
    1.2 多酚氧化酶的细胞定位研究  12
    1.3 多酚氧化酶同工酶的研究  12
    1.4 多酚氧化酶的酶学性质研究  12-13
  2 多酚氧化酶的分子生物学研究进展  13-17
    2.1 多酚氧化酶的分子结构研究进展  13-14
    2.2 多酚氧化酶的基因结构与特性研究进展  14-15
    2.3 多酚氧化酶的蛋白结构研究进展  15
    2.4 多酚氧化酶的基因克隆研究进展  15-16
    2.5 多酚氧化酶的表达与调控研究研究进展  16-17
  3 多酚氧化酶的生理功能研究  17-19
    3.1 多酚氧化酶在茶叶加工中的应用研究  17-18
    3.2 多酚氧化酶与植物抗病性的研究  18
    3.3 多酚氧化酶与植物光和作用的研究  18-19
    3.4 多酚氧化酶的其它功能的研究  19
  4 多酚氧化酶的应用研究进展  19-20
    4.1 多酚氧化酶在茶叶中的应用研究  19
    4.2 多酚氧化酶在食品加工中的应用研究  19-20
    4.3 多酚氧化酶在工业中的应用研究  20
  5 本研究的目的意义  20-22
第2章茶树多酚氧化酶的基因克隆与表达载体构建  22-40
  1 前言  22
  2 材料与方法  22-28
    2.1 材料  22-23
    2.2 试验方法  23-28
  3.结果与分析  28-38
    3.1 PPO的基因克隆结果  28-29
    3.2 PPO基因表达载体的构建  29-32
    3.3 安徽一号和宜红早PPO的生物信息学分析  32-38
  4 讨论  38-39
    4.1 茶树PPO基因不含有内含子  38
    4.2 安徽一号PPO基因序列的差异  38
    4.3 PPO转运肽结构的分析  38-39
  5 小结  39-40
第3章茶树多酚氧化酶的蛋白表达与酶活性测定  40-55
  1 前言  40
  2 材料方法  40-46
    2.1 试验材料  40-44
    2.2 试验方法  44-46
  3 结果与分析  46-52
    3.1 多酚氧化酶基因原核表达结构  46-48
    3.3 宜红早PPO/pET32a蛋白的大量表达与纯化  48-49
    3.4 包涵体的变性与复性  49-50
    3.5 茶树多酚氧化酶酶活性测定结果  50-52
  4.讨论  52-54
    4.1 PPO原核表达载体的选择  52
    4.2 PPO原核表达易形成包涵体  52-53
    4.3 PPO蛋白表达条件的优化  53
    4.4 PPO工程蛋白具有酶活性  53-54
  5 小结  54-55
第4章茶树多酚氧化酶亚蛋白的原核表达  55-67
  1 前言  55
  2 材料与方法  55-57
    2.1 试验材料  55
    2.2 试验方法  55-57
  3 结果与分析  57-65
    3.1 PPO亚蛋白的缺失位点选择  57
    3.2 PPO基因克隆结果  57-58
    3.3 PPO亚蛋白表达载体构建结果  58-61
    3.4 PPO亚蛋白原核表达的结果与分析  61-63
    3.5 PPO-1532亚蛋白包涵体的纯化与分析  63-64
    3.6 多酚氧化酶亚蛋白的活性测定  64-65
  4 讨论  65-66
  5 小结  66-67
参考文献  67-74
致谢  74-75
附表1 多酚氧化酶基因序列比对  75-78
附表2 多酚氧化酶PPO蛋白序列比对  78-79

茶树多酚氧化酶的基因克隆与原核表达

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