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猪铁代谢相关基因的克隆、生物信息学分析及表达分布
作 者: 武宇晓
导 师: 杨国宇
学 校: 河南农业大学
专 业: 基础兽医学
关键词: 猪 铁代谢相关基因 克隆 生物信息学分析 半定量RT-PCR
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
以EST片段为基础,电子延伸获得新的编码基因,通过RT-PCR技术克隆得到相关基因的cDNA序列,并利用生物信息学工具预测其相关生物信息学性质,为进一步探讨相关基因的功能奠定基础,同时利用半定量RT-PCR方法分析了猪细胞色素b还原酶1(CYBRD1)、猪配对的二价金属离子转运蛋白1(DMT1)、猪铁效应元件结合蛋白2(IREB2)、猪Fe+3螯合物还原酶1(FRRS1)基因的时空表达规律并利用生物学软件对各基因相对应的蛋白进行分析。试验成功克隆了猪细胞色素b还原酶1(CYBRD1)、猪配对的二价金属离子转运蛋白1(DMT1)、猪铁效应元件结合蛋白2(IREB2)、猪Fe+3螯合物还原酶1(FRRS1)基因。克隆的CYBRD1基因长960bp包含了完整的开放阅读框,编码285个氨基酸残基的蛋白质。CYBRD1蛋白的分子量为31.53Kda,等电点为9.3,含有32个酸性氨基酸残基和28个碱性氨基酸残基,在第49~78氨基酸残基间有一个B561结构域,在第37~38残基间有信号肽的剪切位点,成熟肽疏水性强。CYBRD1开放阅读框与人、大鼠、小鼠同源性分别为88.2%,80.7%, 81.5%,推测的氨基酸序列同源性分别为84.2%,77.9%,78.9%。有6个蛋白激酶磷酸化的位点和6段明显的跨膜区。二级结构预测表明CYBRD1蛋白前端及中端有一个较长α-螺旋,近末端处主要是β-折叠和转角,末端处还有一个短的α-螺旋。组织表达规律分析表明:CYBRD1在空肠表达量最高,在回肠有中度表达,在盲肠、结肠、直肠、脾脏、肌肉有轻度表达。克隆DMT1基因长1691bp,包含完整的ORF,编码562个氨基酸残基的蛋白质。DMT1蛋白的分子量为61.46Kda,等电点为5.78,含有81个酸性氨基酸残基和45个碱性氨基酸残基,疏水性大于亲水性。DMT1蛋白有9段明显的跨膜区和17个蛋白激酶磷酸化的位点。开放阅读框与人、牛、大鼠、小鼠同源性分别为89.9%、91.1%、87.4%、85.3%。推测的氨基酸序列同源性分别为92.2%、95%、92.3%、90%。二级结构预测表明有一个较长的α-螺旋几乎贯穿DMT1始终。组织表达规律分析表明:DMT1在十二指肠、心脏、空肠前段有高度表达,在空肠中后段、肺脏、脂肪、回肠、脾脏有中度表达,在肾脏、盲肠、结肠、直肠有轻度表达。克隆的FRRS1基因长1785bp包含了完整的ORF,编码591个氨基酸残基的蛋白质。蛋白的分子量为65.6Kda,等电点为8.82,含有76个酸性氨基酸残基和80个碱性氨基酸残基,N端的疏水性较强,且位于信号肽处。在217-359氨基酸残基之间有一个DoH的结构域,在26~27氨基酸残基之间有信号肽的剪切位点,蛋白的近末端处有6个跨膜区,并有24个蛋白激酶磷酸化的位点。FRRS1开放阅读框与牛、人、大鼠变异体1、大鼠变异体2同源性分别为90.3%、87.3%、78.6%、78.6%,推测的氨基酸序列同源性分别为86.6%、76.1%、76.4%、76.4%。二级结构预测表明序列前端及中间部分α-螺旋、β-折叠和转角交替出现,近后端有一较长的α-螺旋。组织表达规律分析表明:FRRS1在空肠、升结肠表达量较高,在直肠、肌肉、心脏、肝脏、脾脏有中度表达,在结肠、胃有轻度表达。克隆IREB2基因长2937bp,包含完整的ORF,编码964个氨基酸残基的蛋白质。蛋白的分子量为105.2Kda,等电点为7.63,含有174个酸性氨基酸残基和120个碱性氨基酸残基,蛋白的亲水性和疏水性基本相当。在289-300及670-681氨基酸残基之间分别有一个低复杂性结构。开放阅读框与人、大鼠、小鼠同源性分别为94.8%、91%、91.1%,推测的氨基酸序列同源性分别为100%、93.8%、94%。IREB2整个蛋白位于细胞外,无跨膜区,共有41个蛋白激酶磷酸化的位点。二级结构预测表明N端主要以α-螺旋为主,序列的中间及C端α-螺、β-折叠和转角交替出现。组织表达规律分析表明:在肌肉、十二指肠、空肠高度表达,在回肠、脾脏、十二指肠、心脏、肺脏、盲肠、直肠、有中度表达,在胃、脑、结肠、肾脏有轻度表达。
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全文目录
致谢 4-9 摘要 9-11 1 文献综述 11-17 1.1 铁的分布与功能 11 1.2 铁的吸收与排出 11-12 1.3 铁的转运、利用和贮存 12-13 1.4 铁的生理功能 13-15 1.5 铁蛋白和转铁蛋白 15-17 2 引言 17-18 3 材料与方法 18-22 3.1 猪铁代谢相关基因的克隆 18-20 3.1.1 仪器与试剂 18 3.1.2 克隆引物的设计 18 3.1.3 组织中总RNA的提取 18-19 3.1.4 反转录反应 19 3.1.5 PCR 扩增 19 3.1.5.1 猪细胞色素b 还原酶1(CYBRD1) PCR 扩增 19 3.1.5.2 猪二价金属离子转运蛋白1(DMT1) PCR 扩增 19 3.1.5.3 猪 Fe~(+3) 螯合物还原酶1(FRRS1)PCR 扩增 19 3.1.5.4 猪铁效应元件结合蛋白2(IREB2) PCR 扩增 19 3.1.6 切胶回收 19 3.1.7 DNA 序列的测定 19-20 3.2 生物信息学分析 20-21 3.2.1 蛋白序列基本性质的分析 20 3.2.2 蛋白质序列的结构功能域分析 20 3.2.3 二级结构和功能分析 20-21 3.2.3.1 信号肽预测 20 3.2.3.2 疏水性分析 20 3.2.3.3 磷酸化位点分析 20 3.2.3.4 跨膜区分析 20 3.2.3.5 二级结构预测 20-21 3.3 基因的表达规律 21-22 3.3.1 半定量引物的设计与合成 21 3.3.2 mRNA 的定量 21 3.3.5 线形增长试验 21-22 3.3.6 组织表达规律 22 4. 结果与分析 22-49 4.1 总RNA 的提取和检测 22-24 4.2 猪细胞色素b 还原酶1(CYBRD1)基因的克隆、生物信息学分析及表达分布 24-30 4.2.1 猪细胞色素b 还原酶1(CYBRD1)基因的PCR 扩增 24 4.2.2 猪细胞色素b 还原酶1(CYBRD1)基因的克隆与鉴定 24 4.2.3 测序结果及序列分析 24-25 4.2.4 同源性比较及系统发育树绘制 25-26 4.2.5 信号肽预测 26-27 4.2.6 疏水性分析 27 4.2.7 磷酸化位点分析 27 4.2.8 跨膜区分析 27-28 4.2.9 二级结构预测 28 4.2.10 表达规律分析 28-30 4.2.10.1 引物的选择 28 4.2.10.2 退火温度对PCR产物灰度的影响 28-29 4.2.10.3 线形增长试验 29 4.2.10.4 不同组织表达分布规律分析 29-30 4.3 DMT1 基因的克隆、生物信息学分析及表达分布 30-36 4.3.1 猪配对的二价金属离子转运蛋白1(DMT1)基因的PCR 扩增 30 4.3.2 猪配对的二价金属离子转运蛋白1((DMT1))基因的克隆与鉴定 30 4.3.3 测序结果及序列分析 30-31 4.3.4 同源性比较及系统发育树绘制 31-32 4.3.5 信号肽预测 32-33 4.3.6 疏水性分析 33 4.3.7 磷酸化位点分析 33 4.3.8 跨膜区分析 33-34 4.3.9 二级结构预测 34 4.3.10 表达规律分析 34-36 4.3.10.1 引物的选择 34 4.3.10.2 退火温度对PCR产物灰度的影响 34 4.3.10.3 线形增长试验 34-35 4.3.10.4 不同组织表达分布规律分析 35-36 4.4 猪 FRRS1 基因的克隆、生物信息学分析及表达分布 36-42 4.4.1 猪 Fe~(+3) 螯合物还原酶1(FRRS1)基因的PCR 扩增 36 4.4.2 猪 Fe~(+3) 螯合物还原酶1(FRRS1)基因的克隆与鉴定 36 4.4.3 测序结果及序列分析 36-37 4.4.4 同源性比较及系统发育树绘制 37-39 4.4.5 信号肽预测 39 4.4.6 疏水性分析 39-40 4.4.7 磷酸化位点分析 40 4.4.8 跨膜区分析 40 4.4.9 二级结构预测 40 4.4.10 表达规律分析 40-42 4.4.10.1 引物的选择 40 4.4.10.2 退火温度对PCR产物灰度的影响 40-41 4.4.10.3 线形增长试验 41 4.4.10.4 不同组织表达分布规律分析 41-42 4.5 猪铁效应元件结合蛋白2(IREB2)的序列分析 42-49 4.5.1 猪铁效应元件结合蛋白2(IREB2)基因的PCR 扩增 42 4.5.2 猪铁效应元件结合蛋白2(IREB2)基因的克隆与鉴定 42 4.5.3 测序结果及序列分析 42-44 4.5.4 同源性比较及系统发育树绘制 44-45 4.5.5 信号肽预测 45-46 4.5.6 疏水性分析 46 4.5.7 磷酸化位点的分析 46-47 4.5.8 跨膜区分析 47 4.5.9 二级结构预测 47 4.5.10 表达规律分析 47-49 4.5.10.1 引物的选择 47 4.5.10.2 退火温度对PCR产物灰度的影响 47-48 4.5.10.3 线形增长试验 48 4.5.10.4 不同组织表达分布规律分析 48-49 5 讨论与结论 49-52 5.1 讨论 49-51 5.2 结论 51-52 参考文献 52-55 英文摘要 55-56 攻读硕士期间发表的学术论文 56-57
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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