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透性化肝素黄杆菌的固定化及其降解肝素的研究

作　者: 周帅
导　师: 王凤山
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 透性化肝素黄杆菌固定化细胞肝素低分子量肝素酶降解
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肝素（heparin）属长链糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）,由硫酸化的葡糖胺和己糖醛酸以β-1,4糖苷键交叉连接而成。低分子量肝素（low molecularweight heparin,LMWH）则是采用不同方法降解肝素获得的寡糖片段。与肝素相比,LMWH具有选择性强、抗血栓作用增强等特点,在临床上应用越来越广泛。不同降解方法所得到的肝素寡糖具有不同的结构,从而具有不同的生物学活性。与化学降解法相比,酶降解法制备LMWH具有反应条件温和、酶切位点清楚、不改变肝素结构以及不引入异物等特点。肝素裂解酶（heparinase）是一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶,最初是从肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）中发现并分离出的。肝素酶的稳定性差,对其纯化过程会造成酶活性的巨大损失,因而产率很低。固定化酶技术因为可以克服酶稳定性差、易失活、不能重复利用等问题而备受关注。本研究以两株肝素黄杆菌为材料,在对其进行透性化处理提高通透性的基础上研究其最佳固定化条件,对制得的固定化细胞的理化性质进行研究,并进一步研究了固定化肝素黄杆菌降解肝素制备LMWH的反应条件、产物性质等,结果表明固定化细胞具有较好的操作稳定性和贮藏稳定性,在合适的反应条件下能够制备分子量较为均一、活性较好的LMWH。本课题的实验设计和已取得的成果如下:（1）完整的肝素酶活性测定体系的建立使用天青A（Azure A）法建立了肝素含量标准曲线,进而建立了完整的肝素酶粗酶液、透性化肝素黄杆菌以及固定化肝素黄杆菌的肝素酶活性测定体系,确保对酶活水平的测定贯穿整个研究的各个阶段,以准确地计算酶活回收率以及稳定性,作为考查粗酶液、透性化细胞以及固定化细胞的重要指标。（2）肝素黄杆菌的培养及诱导条件的确定将两株肝素黄杆菌分别接种于DSMZ培养基和NBRC培养基,测定其生长曲线,选择NBRC培养基进行培养;将菌种于30℃、200r/min条件下培养一定时间至培养液OD600为1.0左右时加入无菌的肝素钠溶液进行诱导,通过对不同浓度肝素钠溶液诱导产酶的研究,确定诱导用肝素钠溶液的浓度为0.1 g/mL;为确保肝素黄杆菌保持菌株的纯正与较高的酶活水平,确定了使用初步筛选培养基培养、镜检、测定肝素酶活性和肝素酶Ⅰ基因HepA PCR鉴定的多角度机制的菌种鉴定方法;分别使用超声波细胞破碎法和高压匀质法对培养和诱导后的肝素黄杆菌菌体进行破碎,得到肝素酶粗酶液,比较了两种方法破碎细胞的效果,确定使用高压匀质法制备肝素酶粗酶液;对粗酶液的操作稳定性和贮藏稳定性进行研究,结果表明粗酶液的酶活稳定性较差,反应5次后酶活性降低至10%以下,而保存于4℃时酶活性逐步降低,贮存120 h后酶活性降至35%左右。（3）肝素黄杆菌的透性化处理分别使用曲拉通X-100（Triton X-100）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、吐温80（Tween 80）以及溶菌酶对肝素黄杆菌进行透性化处理,考查各种透性化试剂处理的操作复杂性和作用效果,确定透性化处理的条件为使用等体积的100 mg/L的溶菌酶于30℃处理30 min,制得的透性化肝素黄杆菌的肝素酶活性回收率达到50%以上;对酶活稳定性的研究表明,透性化细胞的酶活稳定性较粗酶液有较大提高,在最初5个批次的反应过程中酶活性损失较明显,从第6次反应开始酶活基本保持平稳水平,经过10次反应后,酶活保留40%以上。（4）透性化肝素黄杆菌的固定化使用海藻酸钙包埋法对透性化肝素黄杆菌进行固定化,通过正交试验确定固定化最佳条件为1.5%的海藻酸钠、5%的CaCl₂溶液,硬化20 h;对固定化细胞的最适温度、温度稳定性、最适pH、pH稳定性等理化性质进行研究,确定了固定化细胞的最适温度为30℃,最适pH为7.0。与粗酶液相比,固定化细胞的温度稳定性有很大提高,最适温度、最适pH的范围有所扩大;在最佳条件下制备的固定化肝素黄杆菌的酶活回收率平均达到30%左右;固定化细胞的操作稳定性和贮藏稳定性相对于透性化细胞有很大提高,反应10次后酶活性保留60%以上,于4℃贮存120 h后酶活保留90%以上。（5）固定化肝素黄杆菌制备LMWH使用固定化肝素黄杆菌对肝素进行三个批次的不同时间的酶解作用,经过超滤、浓缩及冻干后得到OH-1、OH-2和OH-3三组肝素寡糖样品,对制得的肝素寡糖进行190～350 nm波长范围扫描,显示在232 nm处有最大吸收;测定了三种肝素寡糖的部分理化性质,使用多角度激光散射仪-高效凝胶渗透色谱联用法（GPC-MALLS）测定肝素寡糖的分子量,三种肝素寡糖样品的重均分子量分别为8798 D、6709 D和5671 D,分散度（polydispersity）分别为1.375、1.383和1.408;采用羊血浆法测定肝素寡糖的抗凝效价,COATEST Heparin试剂盒测定其抗FXa活性,三种肝素寡糖样品的抗凝效价分别为26、15和11 USPU/mg,抗FXa活性分别为44、36和32IU/mg,抗FXa与抗FIIa活性的比值均大于1.5。

全文目录

摘要  10-13
Abstract  13-17
第一章前言  17-33
  1 肝素的结构及其生物学功能  17-22
    1.1 肝素的结构  17-18
    1.2 肝素的生物学功能  18-22
  2 LMWH的制备、结构和性质  22-28
    2.1 LMWH的制备  22-27
    2.2 LMWH的化学结构与生物活性的关系  27-28
  3 细胞透性化技术  28-32
    3.1 细胞透化技术  28-30
    3.2 透性化细胞的应用  30-32
  4 本课题拟解决的问题  32-33
第二章肝素黄杆菌的培养及透性化处理  33-48
  1 实验材料、培养基、试剂与仪器  33-34
    1.1 实验材料  33
    1.2 培养基配方  33
    1.3 主要试剂  33-34
    1.4 主要仪器  34
  2 方法  34-40
    2.1 肝素黄杆菌的培养及诱导  34-35
    2.2 肝素黄杆菌生长曲线的测定  35
    2.3 生物量测定  35
    2.4 肝素黄杆菌的鉴定及验证  35-37
    2.5 肝素酶粗酶液的制备  37-38
    2.6 肝素酶活性的测定  38-39
    2.7 肝素黄杆菌的透性化处理及酶活性测定  39-40
  3 结果与分析  40-46
    3.1 肝素黄杆菌生长曲线的测定  40-41
    3.2 肝素酶活性的测定  41-43
    3.3 诱导肝素浓度对产酶的影响  43-44
    3.4 肝素黄杆菌的PCR筛选鉴定  44
    3.5 肝素黄杆菌的透性化处理  44-46
  4 讨论  46-48
第三章透性化肝素黄杆菌的固定化  48-59
  1 实验材料、试剂与仪器  48-49
    1.1 材料  48
    1.2 主要试剂  48
    1.3 主要仪器  48-49
  2 实验方法  49-52
    2.1 固定化方法  49-51
    2.2 固定化细胞理化性质的研究  51-52
    2.3 固定化细胞酶活性的测定  52
  3 结果与分析  52-58
    3.1 固定化细胞的制备  52-54
    3.2 固定化细胞理化性质的研究  54-56
    3.3 固定化细胞酶活性的测定  56
    3.4 固定化细胞稳定性的测定  56-58
  4 讨论  58-59
第四章固定化肝素黄杆菌制备肝素寡糖的研究  59-70
  1 实验材料、试剂与仪器  59-60
    1.1 实验材料  59
    1.2 主要试剂  59
    1.3 主要仪器  59-60
  2 实验方法  60-64
    2.1 固定化细胞对肝素的降解  60
    2.2 降解产物的处理  60-61
    2.3 肝素寡糖的紫外扫描  61
    2.4 肝素寡糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)  61
    2.5 肝素寡糖的分子量测定  61-62
    2.6 肝素寡糖抗凝效价的测定  62-63
    2.7 肝素寡糖抗Xa活性的测定  63-64
  3 结果与分析  64-69
    3.1 固定化细胞对肝素的降解  64
    3.2 紫外扫描图谱  64-66
    3.3 PAGE结果  66
    3.4 分子量及其分布的测定  66-68
    3.5 抗凝效价的测定结果  68
    3.6 抗Xa活性的测定结果  68-69
  4 讨论  69-70
总结与展望  70-72
  1 论文主要结论  70-71
  2 展望  71-72
参考文献  72-80
致谢  80-81
攻读学位期间发表的学术论文  81-82
学位论文评阅及答辩情况表  82

透性化肝素黄杆菌的固定化及其降解肝素的研究

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