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中国人五种CYP450亚型酶基因多态性与混合探针底物代谢差异的相关性研究

作　者: 李纳
导　师: 施孝金
学　校: 复旦大学
专　业: 药剂学
关键词: 细胞色素P450 高效液相色谱-串联质谱法混合探针底物法基因多态性
分类号: R969.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450),主要存在于肝微粒体中,在外源性化合物和内源性物质的生物转化中起着十分重要的作用,根据酶蛋白一级结构中氨基酸的同源度,CYP分为18个家族和44个亚家族,临床上90%以上的药物氧化代谢主要是通过CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4这5种同工酶介导的。影响药物代谢酶活性的因素有很多,如食物和环境毒物等环境因素；年龄和性别等生理性因素；肝、肾或心脏疾病等病理性因素以及遗传因素。其中影响酶活性的重要因素是遗传因素,基因多态性是造成药物代谢种族和个体差异的主要来源。治疗剂量下的药物在弱代谢者中有可能发生严重的不良反应；在强代谢者中则可能无效,起不到治疗疾病的作用。因此,临床上需要预测患者的药物代谢酶活性,实行个体化的治疗方案。研究预测酶活性的方法主要有两种：探针底物法和基因分析法。混合探针底物法的应用较多,其优点有多个代谢途径的信息可在单个试验过程获得,可以降低个体问和个体内药物代谢酶活性变异的影响,同时缩短分析周期,降低实验费用,但是此方法不能应用于肝肾功能不良、对探针底物有不良反应的人群,且存在伦理道德、分析方法要求高等问题。而基因型检测只需很少的血浆,价格便宜,操作简单,可以更方便的应用于临床,但是需要预先鉴定影响代谢的基因分型。开展以基因型为指导的个体化用药是必需的,可以减少药物不良反应的发生,提高药物治疗效果,节约资源。各个亚型酶具有多个突变等位基因,需要探寻基因多态性和酶活性之间的关系,确定各种基因突变型引起的酶功能性的变化,实现通过检测个体的基因型来预测亚型酶对药物代谢的影响,从而优化给药方案,做到个体化给药。同时对临床药物试验筛选受试者也提供了可行的方法,临床试验中弱代谢者的排除,可以提高临床药物试验的安全性和有效性。本研究第一部分首先建立了一种同时测定血浆中CYP450酶的探针底物及其代谢物甲苯磺丁脲/4-羟基甲苯磺丁脲(CYP2C9)、奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑(CYP2C19)右美沙芬/右啡烷(CYP2D6)、咪达唑仑/1’-羟基咪达唑仑(CYP3A4)浓度的LC-MS/MS分析方法。血浆样品预处理方法采用乙腈直接沉淀蛋白后用氮气吹干重组的方法。色谱条件为：色谱柱：CAPCELL PAK C18柱(MGⅢ、100mm×2.0mmID,5μm)流动相A：水/甲酸(100：0.05,v/v),流动相B：乙腈/甲酸(100：0.05,v/v),采用梯度洗脱程序：0～5 min,B%(10%～90%)；5～5.5 min,B%(90%)；5.5～6 min B%(90%-10%)；6-11 min,B%(90%)。流速0.3 mL/min,柱温为室温,进样体积为10μL电喷雾离子源(ESI),三重四级杆串联质谱,多级反应监测进行定量,正负离子分开扫描。奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑、右美沙芬/右啡烷、咪达唑仑/1’-羟基咪达唑仑的浓度采用正离子监测,内标为非那西丁；甲苯磺丁脲/4-羟基甲苯磺丁脲采用负离子监测,内标为氯唑沙宗。结果奥美拉唑在0.4-40 ng/mL,5-羟基奥美拉唑、右美沙芬、1’-羟基咪达唑仑、4-羟基甲苯磺丁脲在0.2～20 ng/mL,右啡烷、甲苯磺丁脲在O.1-10 ng/mL,咪达唑仑在0.3-30 ng/mL范围内线性关系良好(r>0.999)。各分析物的批内及批问精密度均小于15%,准确度均在85%-115%范围内。建立的方法简便、快速、准确、灵敏,同时测定4种CYP450亚型酶的探针底物及其代谢物,可促进混合探针底物法的广泛应用,满足高通量的分析要求。第二部分进行了采用混合探针底物法研究CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的酶活性。选择咖啡因、奥美拉唑、右美沙芬、甲苯磺丁脲和咪达唑仑为探针底物,分别用于CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4酶的活性研究与表型分析。筛选出50名健康受试者,同时给予健康受试者上述5种探针底物后3h,5h,24h采集血样,然后用第一部分建立的LC-MS/MS分析方法,测定血浆中的探针底物及其代谢物的浓度,来预测相应的药物代谢酶活性。结果这5种药物之间无相互作用,受试者在整个试验期间各项监测指标均在正常范围内,无不良事件的发生。血样测定中除咖啡因与副黄嘌呤由于空白血浆中干扰大没有进行准确定量测定外,其余各分析物都进行了精确的测定,测出了50名受试者体内各分析物的血浆浓度,为下一步的研究奠定基础。本研究采用的探针底物组合咖啡因+奥美拉畔+右美沙芬+甲苯磺丁脲+咪达唑仑来同时测定体内CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4的活性,采样方便快捷,可用于同工酶活性和表型的研究以及用于评价药物之间的相互作用等方面。第三部分进行了CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A(?)的基因多态性与探针底物代谢差异的相关性研究。采用直接测序法对50名健康受试者进行了CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4各亚型酶在中国人群中主要突变位点的基因分型研究。同时考察了这些突变位点在本研究人群中的频率分布,并研究了这些亚型酶突变位点的不同基因型对各自的探针底物在体内代谢的影响。所研究的基因多态性位点在本研究人群中的突变基因分布频率分别为CYP1A2*1B(10%)、CYP1A2*1C (31.9%)、CYP1A2*1D(16.4%)、CYP1A2*1F(59%)、CYP2C9*3(6%)CYP2C9*13 (0%)、CYP2C19*2(20.8%)、CYP2C19*3(8.2%)、CYP2D6*10(64.1%)、CYP3A4*1G (26.7%)、CYP3A4*15(0%)、CYP3A4*18(2%)。CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2D6*10的突变位点可以引起相应的酶活性的降低,携带有这些位点突变基因的人群在临床用药中要减少剂量,才能减少不良反应的发生。CYP1A2*1B、CYP1A2*1C、CYP1A2*1D、CYP1A2*1F、CYP2C19*3、CYP3A4*1G、CYP3A4*18位点的突变基因则对各自的酶活性无影响,CYP2C9*13、CYP3A4*15没有检测到突变基因,无法确定其对酶活性的影响。研究结果将为实现以基因型为指导的临床个体化给药提供依据,有利于促进临床上的合理用药,保证用药的安全性。

全文目录

缩写字母表  5-7
中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-14
第一部分同时测定血浆中四种探针底物及其代谢物的LC-MS/MS分析方法的建立与验证  14-43
  1 引言  14-15
  2 实验仪器、对照品、试剂  15
  3 实验方法  15-17
  4 结果  17-19
  5 讨论  19-20
  6 结论  20-21
  7 附图  21-33
  8 附表  33-43
第二部分混合探针底物法研究CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的酶活性  43-61
  1 引言  43-44
  2 仪器与材料  44
  3 研究方法  44-48
  4 结果  48-49
  5 讨论  49-53
  6 结论  53-54
  7 附图  54-56
  8 附表  56-61
第三部分 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的基因多态性与探针底物代谢差异的相关性研究  61-80
  1 引言  61-63
  2 仪器与试剂  63
  3 研究方法  63-65
  4 统计分析  65-66
  5 结果  66-67
  6 讨论  67-70
  7 结论  70-72
  8 附图  72-75
  9 附表  75-80
结语  80-83
参考文献  83-89
综述细胞色素P450酶基因多态性的研究进展及临床意义  89-99
  参考文献  95-99
致谢  99-100
附录攻读学位期间发表的文章(第一作者)和所获奖励  100-101

中国人五种CYP450亚型酶基因多态性与混合探针底物代谢差异的相关性研究

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