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福建沿海鱼类异尖线虫幼虫感染情况调查及其分类鉴定方法的研究

作　者: 冷淑珍
导　师: 王寿昆；郑腾
学　校: 福建农林大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 异尖线虫感染调查形态学鉴定核糖体DNA 内转录间隔区序列分析 PCR PCR-RFLP 特异PCR
分类号: S941.524
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

异尖线虫是世界各大海域鱼类的主要寄生线虫,异尖线虫病属于海洋自然疫源性疾病。人异尖线虫病主要是由于食入含有异尖线虫科某些种的活的三期幼虫引起的。1993年我国将异尖线虫病列入了《中华人民共和国禁止进境的动物传染病、寄生虫病名录》。由于我国是一个海鱼消费大国,因此对异尖线虫进行准确的种类鉴定不仅是从事异尖线虫研究的前提和基础,也对防治人和动物的异尖线虫病具有重要意义。本研究对福建沿海养殖渔排异尖线虫感染情况进行了调查,感染率最高的是真鲷、鲈鱼、带鱼、美国红鱼,主要集中在7-9月份,送检样品的感染率可达到100.00%。其中感染强度最高的是真鲷,在8月上旬,感染强度可以达到43.00条/尾。而秋刀鱼和海洋软体动物鱿鱼、墨鱼检出率为零,但并不能排除它们感染异尖线虫的可能。而对于福州口岸进口海水鱼类,感染率最高的是带鱼和鳗鱼,高达100.00%,其中鳗鱼的感染强度可达59.43条/尾。而抽检的鱿鱼、墨鱼等海洋软体动物感染率则为零,这与福建沿海渔排送检样品的检查结果是一致的。异尖线虫体外存活试验结果显示:在不同温度下存活试验中,6℃的存活时间最长,即在类似鱼体温度中可以存活多达一个月的时间,反映了异尖线虫在鱼体中造成长时间的持续感染;在最适温度下不同调料存活试验中,虫体在56℃白酒中存活时间最短,其次是在大蒜原汁中的存活时间。而在其他调料中的存活时间之长出乎意料,这证明生鱼片短时间的腌制,不可能将异尖线虫幼虫杀死。异尖线虫幼虫传统的分类方法主要为形态学鉴定法。在已有的工作基础上,本研究第二章介绍了如何用形态学方法对异尖线虫做初步的鉴定,将采集到的异尖线虫幼虫鉴定到属(个别种类可以鉴定到种)。形态学鉴定结果显示,从福建周边海域养殖渔排真鲷、鰤鱼等大部分养殖鱼种体内检获的异尖线虫为简单异尖线虫,可分为简单异尖线虫Ⅰ型和简单异尖线虫Ⅱ型。而采自马来西亚带鱼、印尼红目鲢和福建养殖渔排三线鸡鱼、美国红鱼体内的异尖线虫则为宫脂属异尖线虫。其中,检自马来西亚带鱼、印尼红目鲢和美国红鱼体腔的绝大部分异尖线虫为灰海鳗对盲囊线虫(Contracaecum murenesoxi)。本研究将分子分类方法与形态学鉴定方法相结合,得到较为理想的鉴定结果,并建立了一套可用于对异尖线虫种类做出快速、准确鉴定的特异PCR检测方法。首先,用通用引物扩增出间隔区片段,之后送样测序。再将所得序列与NCBI上Genebank序列相比较,即可将大部分虫体鉴定到种。通过测序,本实验可将测序样品鉴定为:A. pegreffii、C. murenesoxi、A. typica、A. physeteris和H. aduncum。对于尚有疑虑的样品,则用分子方法进一步加以鉴定。本实验中,对仅凭测序尚不能确定到种的样品FJ-1、FJ-2、FJ-3、SD、SH和HY-1,运用PCR-RFLP和错配PCR的方法将其分别鉴定为:A. pegreffii、A. pegreffii、A. pegreffii、A. pegreffii、A. pegreffii和Hybrid genotype。其次,则是设计特异引物,建立异尖线虫的特异PCR检测方法。本研究设计了科、属和种这三个分类单元的特异引物,其中K1为兼并引物。通过实验证明,各引物的特异性好,不扩增其它对照虫体及宿主的DNA。本研究中特异PCR的敏感性结果相差较大,敏感度范围为0.00689 -1.03906 ng,这主要与引物设计有关,敏感性处于较高水平。本研究对福建沿海养殖渔排常见鱼种异尖线虫感染情况做了一个调查,结果表明,不同鱼种感染异尖线虫种类和强度不同,时间不同感染强度也不同,有较为明显的季节倾向。这对实际生产养殖中,海水鱼类疾病的防控起到一个指导作用。在特异PCR方法的建立上,本研究对种以上的分类单元进行了特异PCR鉴定,这是本研究较为新颖和有特色的地方,可应用于检验检疫部门对异尖线虫种类做出快速、准确的鉴定。本研究结果为异尖线虫的进一步研究奠定了基础。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
常用英文缩写  13-14
前言  14-24
第一章福建沿海养殖渔场和福建口岸进口海水鱼类异尖线虫感染情况调查及其体外存活试验  24-31
  第一节异尖线虫感染情况调查  24-28
    1 材料与方法  24-25
      1.1 材料  24
        1.1.1 鱼体材料  24
        1.1.2 剖检工具  24
        1.1.3 其它材料  24
      1.2 方法  24-25
        1.2.1 异尖线虫的收集和保存  24
        1.2.2 异尖线虫的活体形态学鉴定  24-25
    2 结果  25-28
  第二节异尖线虫体外存活试验  28-31
    1 材料与方法  28-29
      1.1 材料  28
        1.1.1 虫体材料  28
        1.1.2 使用试剂及其配制  28
        1.1.3 仪器设备  28
      1.2 方法  28-29
        1.2.1 异尖线虫在不同温度下的存活试验  28-29
        1.2.2 异尖线虫在各种调味料中的存活试验  29
    2 结果与分析  29-31
      2.1 不同温度下存活时间  29
      2.2 6℃下调味料中的存活时间  29-31
第二章异尖线虫三期幼虫形态学鉴定的初步研究  31-42
  1 材料与方法  31-32
    1.1 材料  31
      1.1.1 虫体样品  31
      1.1.2 使用试剂及其配制  31
      1.1.3 仪器设备  31
    1.2 方法  31-32
      1.2.1 线虫标本的采集  31-32
      1.2.2 线虫标本的固定与保存  32
      1.2.3 异尖线虫标本的形态学鉴定  32
  2 结果与分析  32-41
    2.1 异尖线虫属幼虫Anisakis Larvae  33-36
      2.1.1 异尖属Ⅰ型幼虫Anisakis Type I  33-34
      2.1.2 异尖属Ⅱ型幼虫Anisakis TypeⅡ  34-36
    2.2 宫脂线虫属幼虫Hysterothylacium Larvae  36-41
      2.2.1 灰海鳗对盲囊线虫幼虫Contracaecum murenesoxi Larvae  36-38
      2.2.2 宫脂线虫幼虫Hysterothylacium Larvae  38-41
  3 讨论与小结  41-42
第三章 ITS rDNA 序列及PCR-RFLP 用于异尖线虫种类鉴定的研究  42-64
  1 材料与方法  42-51
    1.1 材料  42-44
      1.1.1 样品  42-43
      1.1.2 酶类及试剂  43-44
      1.1.3 仪器设备  44
    1.2 方法  44-51
      1.2.1 样品DNA 模板的制备  44-46
      1.2.2 虫体ITS 嵌套PCR 扩增  46-47
      1.2.3 测序样品的PCR 扩增与鉴定  47
      1.2.4 测序样品ITS-2 基因的序列测定  47-48
      1.2.5 DNA 序列分析  48
      1.2.6 测序样品FJ-1、FJ-2、FJ-3、SD、SH、HY-1 的ITS 基因片段的PCR-RFLP鉴定  48-49
      1.2.7 测序样品FJ-1、FJ-2、FJ-3、SD、SH、HY-1 的特异PCR 鉴定  49-51
  2 结果与分析  51-63
    2.1 ITS 片段PCR 扩增结果  51-52
      2.1.1 全ITS 片段PCR 扩增结果  51
      2.1.2 ITS-2 片段PCR 扩增结果  51-52
    2.2 测序结果及分析  52-60
      2.2.1 ITS-2 基因片段的测序结果  52-59
      2.2.2 24 个测序样品NCBI 基因库BLAST 结果  59
      2.2.3 DNA 序列分析结果  59-60
    2.3 测序样品FJ-1、FJ-2、FJ-3、SD、SH 和HY-1 的定种鉴定  60-63
      2.3.1 ITS 片段的PCR-RFLP 鉴定结果及分析  60-61
      2.3.2 特异PCR 鉴定结果及分析  61-63
  3 讨论与小结  63-64
第四章异尖线虫特异PCR 检测方法的建立  64-89
  1 材料与方法  64-70
    1.1 材料  64-65
      1.1.1 样品  64
      1.1.2 酶类及试剂  64-65
      1.1.3 仪器设备  65
    1.2 方法  65-70
      1.2.1 引物设计  65-67
      1.2.2 PCR 扩增条件的优化  67-68
      1.2.3 特异PCR 引物验证  68
      1.2.4 特异PCR 反应条件退火温度的优化  68
      1.2.5 特异PCR 引物的敏感性检测  68-70
  2 结果  70-86
    2.1 PCR 扩增条件的优化结果  70-71
      2.1.1 PCR 反应体系的比较结果  70
      2.1.2 反应条件退火温度优化结果  70-71
      2.1.3 反应条件的循环数优化结果  71
    2.2 特异PCR 引物特异性的验证结果  71-77
      2.2.1 科特异引物的特异性验证结果  71-74
      2.2.2 属特异引物的特异性验证结果  74-75
      2.2.3 种特异引物的特异性验证结果  75-77
    2.3 特异PCR 引物退火温度的优化结果  77-81
      2.3.1 科引物退火温度的优化结果  77-79
      2.3.2 属引物退火温度的优化结果  79
      2.3.3 种引物退火温度的优化结果  79-81
    2.4 特异PCR 引物的敏感性检测结果  81-86
      2.4.1 特异PCR 科引物的敏感性检测结果  81-83
      2.4.2 特异PCR 属引物的敏感性检测结果  83-84
      2.4.3 特异PCR 种引物的敏感性检测结果  84-86
  3. 讨论与小结  86-89
全文总结  89-90
参考文献  90-96
致谢  96-97
附录A：攻读硕士学位期间论文发表情况  97

福建沿海鱼类异尖线虫幼虫感染情况调查及其分类鉴定方法的研究

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