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目的严重创伤、全身感染、肝病以及众多的危重疾病在其发生发展过程中都可发生肠源性内毒素血症,损伤肝细胞,引发肝衰竭。临床研究发现,对于重症监护、烧伤、脓毒血症及感染性休克等危重疾病患者给予胰岛素强化治疗可改善病人症状,降低病人死亡率及其合并症的发生率,但其作用机制尚不清楚。本实验探讨胰岛素对于内毒素血症中肝细胞损伤的保护作用及其可能的作用机制,期望为临床上肝病治疗研究提供新的思路。方法1、MTT比色法(1) LPS损伤作用:设正常对照组及10,20,40,80μg/ml四个LPS浓度组,各浓度设12,24,36,48 h四个干预时间,采用MTT比色法对各LPS损伤浓度和作用时间进行筛选。(2)胰岛素保护作用:设正常对照组、LPS损伤组(20μg/ml)、不同浓度(2.5,5,10,20 IU/ml)的胰岛素保护组及对照组,各浓度设12,24,36,48 h四个干预时间,采用MTT比色法对各组细胞的存活率进行检测。2、Annexin-V/PI双染法Annexin-V/PI双染法检测正常对照组、LPS损伤组(20μg/ml)、不同浓度的胰岛素(2.5,5,10,20 IU/ml)保护组各组24 h细胞凋亡率。3、实时定量PCR实时定量PCR检测正常对照组、LPS损伤组(20μg/ml)、不同浓度(2.5,5,10,20 IU/ml)的胰岛素保护组凋亡相关基因bcl-2,bax和凋亡相关蛋白Caspase-3的基因表达情况。结果1、经MTT比色法检测,LPS对HL7702细胞具有损伤作用,其诱导的细胞存活率的降低具有剂量和时间依赖性。10,20,40,80μg/ml LPS处理12,24,36,48 h后与正常对照组相比,细胞存活率均有显著性差异(P＜0.01)。而加入2.5,5,10,20 IU/ml胰岛素共同培养12,24,36,48 h后,可减少细胞死亡率,提高细胞存活率,各浓度及各作用时间与20μg/ml LPS损伤组相比,有显著性差异(P＜0.01)。2、Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率结果显示,20μg/ml LPS处理24 h后,凋亡细胞的比例为28.83±1.32%,与正常对照组9.38±0.39%相比是增加的(P＜0.01),而加入2.5,5,10,20 IU/ml胰岛素处理后,凋亡细胞比例分别降至:23.33±1.15%,20.76±1.21%,14.61±0.91%和12.30±1.23%,与20μg/ml LPS损伤组相比有显著性差异(P＜0.01)。3、实时定量RT-PCR结果显示,20μg/ml LPS处理24 h后,与正常对照组相比,细胞的bcl-2 mRNA表达(0.56±0.12)显著降低(P＜0.01),bax mRNA表达(1.37±0.08)和Caspase-3 mRNA表达(0.95±0.10)显著升高(P＜0.01)。胰岛素可减轻bcl-2 mRNA表达下降与bax,Caspase-3 mRNA表达升高的程度,且这种影响呈剂量依赖性。经2.5,5,10,20 IU/ml胰岛素处理后,细胞bcl-2 mRNA表达分别增至:0.76±0.10,0.89±0.08,1.01±0.17和1.20±0.14;bax mRNA表达分别降至:1.21±0.16,1.02±0.10,0.91±0.06和0.78±0.05;Caspase-3 mRNA表达分别降至:0.81±0.05,0.72±0.04,0.58±0.38和0.49±0.05,除外2.5 IU/ml胰岛素保护组外,其他剂量胰岛素保护组基因的表达与20μg/ml LPS损伤组相比均有显著性差异(P＜0.05)。结论1、LPS可以损伤体外培养的人正常肝细胞HL7702细胞并诱导其凋亡。2、胰岛素能抑制LPS诱导的体外培养HL7702细胞损伤和凋亡的发生,对HL7702细胞具有保护作用,效果呈剂量依赖性。3、胰岛素拮抗LPS诱导HL7702细胞凋亡的机制可能包括(1)胰岛素可通过抑制凋亡相关蛋白Caspase-3基因的表达,进而抑制LPS诱导的肝细胞凋亡,发挥保护肝细胞的作用。(2)胰岛素可通过促进抗凋亡基因bcl-2表达,抑制促凋亡基因bax表达,进而抑制LPS诱导的肝细胞凋亡,发挥保护肝细胞的作用。
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