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亚洲玉米螟对几种Bt蛋白的交互抗性及其中肠上结合位点的研究

作 者: 韩海亮
导 师: 何康来
学 校: 中国农业科学院
专 业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 亚洲玉米螟 Bacillus thuringiensis Bt抗性 交互抗性 受体蛋白 钙粘蛋白
分类号: S435.132
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 128次
引 用: 1次
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内容摘要


亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是我国玉米的重要害虫,Bt玉米为其防治开辟了新的途径。然而害虫抗性对Bt玉米的长期有效使用提出了挑战。虽然跨国公司和我国研发的不同转Bt基因玉米先后进入环境安全评价,但亚洲玉米螟对不同蛋白的交互抗性还未见报道。实验室汰选已经得到了对Cry1Ab和Cry1Ac产生抗性的亚洲玉米螟种群。庇护所和多基因策略是目前应用较多的抗性治理策略。成功的抗性治理策略基于对Bt杀虫机制和抗性产生机理的深入了解。因此,深入研究Bt对玉米螟杀虫机制,及玉米螟对不同Bt蛋白产生交互抗性的机理,对指导制定抗性治理计划、研发新的转Bt抗虫玉米具有重要的意义。本文研究了Cry1Ac抗性亚洲玉米螟对几种Bt蛋白的交互抗性,分析了不同蛋白与中肠BBMV的竞争结合,并分段表达了类钙粘蛋白基因,对其与Cry1Ab的结合能力做了初步研究,主要结果如下:通过在人工饲料中添加Cry1Ac蛋白进行室内汰选27代,获得了对Cry1Ac产生了14倍抗性的玉米螟品系ACB-AcR,继续在恒压下连续汰选至82代,相对抗性达到48.9倍。进一步测定和比较4种Bt蛋白Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ah和Cry1Ie对敏感品系ACB-BtS与抗性品系ACB-AcR的毒力,4种蛋白对ACB-BtS的毒力大小依次为:Cry1Ah>Cry1Ab>Cry1Ac>Cry1Ie,ACB-AcR品系对Cry1Ah有显著的交互抗性,相对抗性倍数达到14.9倍,与Cry1Ab的交互抗性水平较低,相对抗性倍数为6.3倍,而与Cry1Ie没有交互抗性,相对抗性倍数为0.9。剂量-生长抑制率曲线表明4种蛋白对亚洲玉米螟幼虫生长发育具有显著的抑制作用。当Cry1Ac、Cry1Ab和Cry1Ah蛋白在<0.5μg/g时,生长抑制率即达到70%-95%。提取ACB-BtS中肠BBMV,利用生物素标记的Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ie蛋白与BBMV进行结合,3种蛋白都可以与BBMV结合,且结合具有浓度效应。异源竞争结果表明,Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ie 3种Bt蛋白在亚洲玉米螟中肠BBMV上存在共同的结合位点,他们与BBMV的结合能力以Cry1Ab为最强,其次是Cry1Ac,以Cry1Ie最弱。Cry1Ab和Cry1Ac在亚洲玉米螟中肠BBMV上有共同的结合位点,表明了Cry1Ac抗性亚洲玉米螟对Cry1Ab具有交互抗性的原因,但还不能解释为什么对Cry1Ie没有交互抗性产生。利用大肠杆菌表达系统分段表达了亚洲玉米螟中肠类钙粘蛋白基因,得到了分子量为25.7、32.8、40.3和83.9kDa的4条多肽,利用这4条多肽分别与生物素化的Cry1Ab蛋白结合,结果表明40.3kDa多肽可以与Cry1Ab结合,此结合区域为钙粘蛋白基因编码的1003-1317位315个氨基酸,对应类钙粘蛋白基因cDNA开放阅读框序列的3007-3951位碱基。通过本论文的研究初步分析了Cry1Ac抗性亚洲玉米螟的交互抗性模式,揭示了Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ie对亚洲玉米螟的毒力水平及其与中肠BBMV结合能力的关系,同时证明了类钙粘蛋白是Cry1Ab在亚洲玉米螟中肠上的受体位点,为亚洲玉米螟Bt抗性机理的研究奠定了基础,并对转Bt基因玉米的研发应用提供了参考依据。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章 引言  12-21
  1.1 转基因玉米的应用概况  12-14
  1.2 Bt 蛋白的分类与作用机理  14-15
    1.2.1 Bt 蛋白的分类  14
    1.2.2 Bt 蛋白的作用机理  14-15
  1.3 昆虫对Bt 抗性的生理生化基础  15-17
    1.3.1 Bt 毒素溶解和活化的改变  15-16
    1.3.2 Bt 毒素特异受体的改变  16
    1.3.3 抗性产生的其他途径  16-17
  1.4 昆虫Bt 受体蛋白及其与抗性的关系研究进展  17-20
    1.4.1 氨肽酶N  17-18
    1.4.2 钙粘蛋白  18-19
    1.4.3 其他受体蛋白  19-20
  1.5 本论文研究的目的与意义  20-21
第二章 Cry1Ac 抗性亚洲玉米螟对几种 Bt 蛋白的交互抗性  21-27
  2.1 材料和方法  21-23
    2.1.1 供试昆虫  21-22
    2.1.2 供试Bt 蛋白  22
    2.1.3 毒力生物测定  22
    2.1.4 数据统计与分析  22-23
  2.2 结果与分析  23-26
    2.2.1 取食不同Bt 蛋白对抗感亚洲玉米螟品系的死亡率  23-24
    2.2.2 取食不同Bt 蛋白对抗感亚洲玉米螟品系的生长抑制率  24-26
  2.3 讨论  26-27
第三章 Cry1Ac、Cry1Ab 与 Cry11e 与亚洲玉米螟中肠 BBMV 的结合竞争  27-36
  3.1 实验材料  27-29
    3.1.1 供试昆虫  27
    3.1.2 主要试剂  27-28
    3.1.3 缓冲液  28-29
    3.1.4 主要仪器设备  29
  3.2 实验方法  29-31
    3.2.1 Bt 蛋白的提取  29-30
    3.2.2 BBMV 的提取  30
    3.2.3 BBMV 的溶解  30
    3.2.4 提取的Bt 蛋白的酶解活化  30
    3.2.5 蛋白的生物素标记  30-31
    3.2.6 转印电泳  31
    3.2.7 Bt 蛋白与亚洲玉米螟中肠BBMV 的体外结合实验  31
  3.3 结果与分析  31-34
    3.3.1 BBMV 的电泳图谱  31-32
    3.3.2 活化和生物素标记的Cry1Ab、Cry1Ac 和Cry11e 蛋白  32-33
    3.3.3 Bt 蛋白与亚洲玉米螟中肠BBMV 结合与竞争分析  33-34
  3.4 讨论  34-36
第四章 亚洲玉米螟中肠类钙粘蛋白基因的克隆与表达  36-50
  4.1 实验材料  36-37
    4.1.1 昆虫种群和Bt 蛋白  36
    4.1.2 主要试剂  36-37
    4.1.3 缓冲液  37
    4.1.4 主要仪器  37
  4.2 试验方法  37-43
    4.2.1 总RNA 的提取  37
    4.2.2 cDNA 的合成  37-38
    4.2.3 PCR 扩增全长和片段序列  38-40
    4.2.4 表达载体的构建  40-42
    4.2.5 原核表达  42
    4.2.6 Ligand blot 检测与Cry1Ab 蛋白的结合  42-43
  4.3 结果与分析  43-49
    4.3.1 亚洲玉米螟中肠总RNA 的提取  43
    4.3.2 PCR 获得不同长度的CAD 片段  43
    4.3.3 含不同CAD 基因片段的表达载体的构建  43-45
    4.3.4 不同CAD 基因片段的原核表达  45-46
    4.3.5 Ligand Blot  46-49
  4.4 讨论  49-50
参考文献  50-61
致谢  61-62
作者简历  62

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