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猪肌节同源异型框基因MSX1的克隆、定位及其有效siRNA的筛选

作　者: 程会军
导　师: 樊斌；赵书红
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: MSX1 克隆定位时空表达分析亚细胞定位 siRNA 猪
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

猪肉是我国居民日常生活中动物性蛋白的主要来源。对猪的肉质性状研究一直是动物遗传育种学家研究的重点。应用现代分子生物学、分子遗传学及数量遗传学等技术进行猪骨骼肌生长发育的分子机理研究，能够增进人们对动物肌肉生长发育规律的深入认识，进而促进动物产肉性状的遗传改良。MSX1(muscle segment homeobox homolog 1，肌节同源异型框基因)是核转录抑制因子，与TATAbox结合蛋白及其它因子共同形成核转录复合物，是器官发育过程中的主调控基因之一。在模式生物如小鼠中的研究表明，MSX1与成肌调控因子MyoD、Pax3等发生作用，调控骨骼肌细胞的分化过程。本研究将MSX1基因作为影响骨骼肌生长发育的候选基因进行研究，结合生物信息学方法及分子生物学技术分离其cDNA，而后开展染色体定位、时空表达谱分析、亚细胞定位和有效siRNA筛选等研究，为深入探讨该基因在猪骨骼肌细胞增殖、分化中的作用提供基础资料。本研究取得如下结果：1．依据人MSX1基因cDNA信息，在NCBI数据库中搜索猪的EST信息，将搜索到的猪EST拼接成EST重叠群。以该序列信息为基础设计引物，克隆获得猪MSX1基因完整CDS序列及包含AATAAA序列在内的3’非翻译区(3’-UTR)。2．利用辐射杂种板(RH)和体细胞杂种板(SCHP)分别对猪MSX1基因进行染色体区域定位和精细定位。结果表明，MSX1位于SSC8(1／2 p21)-p23，与微卫星S0353紧密连锁(LOD=10.22)，还与微卫星SW2410和S0098紧密连锁。3．利用半定量RT-PCR技术检测MSX1基因在猪心脏、肝脏和骨骼肌等组织中mRNA的表达量，发现该基因在所检测组织中均有表达，其中在脾脏中表达量最高，其次为心脏和骨骼肌组织。4．利用半定量RT-PCR技术对猪MSX1基因在通城猪胚胎33天、65天、90天和出生后2天、28天的骨骼肌及长白猪33天、65天、90天胚胎骨骼肌中mRNA的表达量，结果发现该基因在胚胎期表达量逐渐降低，在出生后2天骨骼肌中表达量升高，然后又呈降低趋势。5．构建猪MSX1基因GFP融合蛋白表达载体，转染猪肾细胞系才细胞，应用激光共聚焦技术对融合蛋白的分布进行检测，结果显示猪MSX1-GFP融合蛋白主要表达于细胞核中。6．分别利用shRNA表达载体和化学合成Stealth siRNA方法制备siRNA序列，借助IB细胞，对靶向猪MSX1基因siRNA序列进行筛选，得到2条靶向猪MSX1基因的有效序列。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
缩略词表(ASBREVIATIONS)  10-11
1 文献综述  11-21
  1.1 猪骨骼肌的发生、发育及其调控  11-12
  1.2 新基因的分离策略  12-15
    1.2.1 利用基因文库分离目的基因  12-13
    1.2.2 利用芯片技术分离基因  13
    1.2.3 综合生物信息学和分子生物学技术分离新基因  13-14
    1.2.4 利用比较基因组学策略分离新基因  14-15
  1.3 动物基因功能的研究方法  15-16
    1.3.1 转基因动物与基因功能研究  15
    1.3.2 基因敲除与基因功能研究  15-16
    1.3.3 基因敲入与基因功能研究  16
    1.3.4 基因诱捕与基因功能研究  16
  1.4 哺乳动物细胞细胞中RNA干扰技术的研究进展  16-18
    1.4.1 RNA干扰的作用机制  16-17
    1.4.2 RNA干扰的分子生物学特性  17
    1.4.3 哺乳动物细胞中RNA干扰基数的应用及其研究进展  17-18
  1.5 同源异型框基因MSX1的研究进展  18-21
2 研究目的和意义  21-22
3 材料和方法  22-38
  3.1 材料  22-27
    3.1.1 样品  22
    3.1.2 载体、菌株、细胞系  22-24
    3.1.3 试剂盒和酶  24
    3.1.4 主要试剂及配置  24-26
    3.1.5 主要仪器设备及耗材  26
    3.1.6 主要分子生物学软件及数据库  26-27
  3.2 方法  27-38
    3.2.1 候选基因的克隆  27-30
    3.2.2 基因染色体定位的SCHP法和RH法  30-31
    3.2.3 基因的表达谱分析  31-32
    3.2.4 融合蛋白的亚细胞定位  32-35
    3.2.5 MSX1基因有效siRNA的筛选  35-38
4 结果  38-51
  4.1 猪MSX1基因的克隆与序列分析  38-43
    4.1.1 猪MSX1基因的克隆及cDNA序列分析  38-40
    4.1.2 MSX1基因编码蛋白的结构与功能预测  40-41
    4.1.3 MSX1基因编码蛋白的多序列比对与系统发生树构建  41-43
  4.2 猪MSX1基因的染色体定位  43-44
    4.2.1 染色体区域定位结果  43-44
    4.2.2 精细定位结果  44
  4.3 猪MSX1基因的时空表达谱研究  44-45
    4.3.1 猪MSX1基因组织表达谱分析结果  44-45
    4.3.2 猪MSX1基因时期表达谱分析结果  45
  4.4 猪MSX1基因编码蛋白的亚细胞定位  45-47
    4.4.1 亚细胞定位预测  45-46
    4.4.2 猪MSX1基因编码蛋白的亚细胞定位结果  46-47
  4.5 猪MSX1基因的有效SIRNA筛选  47-51
    4.5.1 shRNA表达载体法筛选有效siRNA  47-49
    4.5.2 化学合成siRNA法筛选有效siRNA  49-51
5 讨论  51-55
  5.1 关于MSX1基因的分离  51
  5.2 关于MSX1基因的物理定位  51-52
  5.3 关于MSX1基因的表达谱分析  52-53
  5.4 关于MSX1基因的亚细胞定位  53
  5.5 关于MSX1基因有效SIRNA的筛选  53-55
    5.5.1 关于shRNA表达载体  53
    5.5.2 关于Stealth siRNA  53
    5.5.3 关于siRNA的干扰效果  53-55
6 小结  55-57
  6.1 本研究所取得的成果  55
  6.2 本研究的创新点  55
  6.3 下一步值得研究的问题  55-57
参考文献  57-63
在读期间发表的论文题录  63-64
致谢  64

猪肌节同源异型框基因MSX1的克隆、定位及其有效siRNA的筛选

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