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骨髓间充质干细胞移植促进大鼠糖尿病后肢缺血血管新生研究

作　者: 吴春朋
导　师: 张潜
学　校: 遵义医学院
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 骨髓 间质干细胞移植 糖尿病血管病变 疾病模型
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：建立从大鼠骨髓分离、培养间充质干细胞的标化流程,并用BrdU标记的大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)肌肉注射移植,探讨其对大鼠糖尿病后肢缺血模型的血管新生作用证据。方法：(1)大鼠BMMSCs分离、培养与表型鉴定：无菌条件下剪取2～3周龄SD大鼠两侧完整股骨,采用D-PBS冲洗骨髓腔,含骨髓细胞的洗脱液经离心后收集细胞沉淀,用含10%FBS的LG-DMEM,于37℃、5%CO2、饱和湿度环境下进行BMMSCs原代培养,每2d换液1次,同时洗脱未贴壁的血细胞；当BMMSCs生长汇合度达60%～70%时,按2～5×105/ml细胞密度进行传代培养。采用流式细胞术对第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子检查,并对其进行BrdU体外标记。(2)大鼠糖尿病后肢缺血模型制备：采用体重180～250 g雄性SD大鼠,经普食喂养1周后,按55 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型；于注射后1 d、7d、14d剪尾取血测血糖浓度,以血糖值大于16.7 mmol/L作为糖尿病制模成功标准；糖尿病大鼠经10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后,无菌条件下于腹股沟韧带下方手术离断、结扎双侧股动脉,并剥离其周围远端分支血管,制备糖尿病后肢缺血模型。(3)模型BMMSCs移植：取第3代BrdU标记BMMSCs,用250μl生理盐水制成单细胞悬液(含细胞总数2～5×106个),自股动脉离断处起分10个点将干细胞悬液注射入模型大鼠左后肢的股直肌和腓肠肌中：右后肢相同部位注射等量生理盐水作为对照。(4)移植评价：于移植后2w、6w、10w随机选取模型大鼠,采用腹主动脉顺行穿刺插管,采用30%碘海醇,以1 ml/s速度、111KPa压力注入4 m1造影剂,进行数字减影血管造影(DSA),以检测双后肢动脉灌注情况；造影后分别取糖尿病模型大鼠及移植后2w、6w、10w大鼠双侧股直肌和腓肠肌,常规石蜡包埋、切片(厚5μm)及HE染色,置光镜下观察,分别统计股直肌和腓肠肌的血管数和肌纤维数,以两者比值计算血管密度；实验还采用免疫组化法,对部分石蜡切片的BrdU标记BMMSCs移植细胞的体内存活与转归进行检测分析。结果：(1)分离纯化的大鼠BMMSCs具有典型的间充质干细胞表型特征,高表达CD90和CD29,不表达CD45：BrdU标记BMMSCs阳性率为82±3%。(2)STZ注射前及注射1 d、7 d、14 d的大鼠外周血血糖值分别为5.4±0.5 mmol/L、27.3±1.6 mmol/L、27.3±2.2 mmol/L、25.4±2.3 mmol/L,注射STZ后的血糖检测值均高于16.7 mmol/L的糖尿病制模标准；经双后肢结扎剥离股动脉及其分支后,后肢骨骼肌出现急性缺血并呈暗紫色。(3)DSA结果显示,模型大鼠股动脉在腹股沟韧带处中断,移植2w后双后肢可见血管显影,左侧后肢较右侧后肢血管稍丰富,移植6w双后肢血管更为丰富,左侧高于右侧,移植10w更为明显。(4)HE染色切片血管密度分析显示,移植后2w,左后肢股直肌与腓肠肌的血管密度分别为0.296±0.10、0.357±0.15,高于右后肢相应部位骨骼肌中的密度(分别为0.132±0.06和0.225±0.08)(P值均<0.05)。(5)免疫组化结果显示,移植后2 w,左侧股直肌肌纤维间见BrdU标记阳性移植细胞,部分移植细胞还参与了血管壁构成。结论：成功分离培养了具有间充质干细胞表型特征的大鼠BMMSCs;局部注射移植BrdU标记的大鼠BMMSCs可改善糖尿病后肢缺血大鼠后肢的血供,并参与了小血管壁的构成,提示BMMSCs移植有助于糖尿病后肢缺血组织的血管新生。

全文目录


摘要  7-9Abstract  9-12前言  12-151 材料  15-17  1.1 实验动物  15  1.2 主要试剂  15  1.3 主要仪器及耗材  15-16  1.4 主要试剂配制  16-172 方法  17-20  2.1 大鼠BMMSCs的分离、培养与表型鉴定  17-18  2.2 大鼠糖尿病后肢缺血模型制备  18  2.3 模型BMMSCs移植  18-19  2.4 移植BMMSCs促进血管新生评价  19-20  2.5 统计学处理  203 结果  20-27  3.1 大鼠BMMSCs培养形态  20-22  3.2 大鼠BMMSCs的表型特征  22-23  3.3 BRDU体外标记大鼠BMMSCs的效果  23-24  3.4 大鼠糖尿病模型下肢缺血模型制备评价  24-25  3.5 DSA血管造影结果  25  3.6 毛细血管密度分析结果  25-26  3.7 移植BRDU标记BMMSCs的体内示踪结果  26-274 讨论  27-305 结论  30-31参考文献  31-34综述:骨髓干细胞移植治疗糖尿病足的研究进展  34-38  参考文献  36-38致谢  38-39作者简介  39

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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