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小鼠再生肝抗GalN/LPS联合诱导急性肝损伤的UCP2作用研究

作　者: 王耀锋
导　师: 邹原
学　校: 大连医科大学
专　业: 生理学
关键词: 解偶联蛋白2 京尼平肝细胞再生肝
分类号: R575.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:肝脏是人体内最为重要的器官之一。临床上因缺血/再灌注、创伤、肿瘤等原因均可导致肝损伤,如何防治肝损伤和提高肝损伤后的修复功能,是临床上亟待解决的难题。已知发育成熟的动物肝脏在生理条件下,几乎不进行细胞分裂增殖。但是当肝脏受到毒性损害或者外科切除的时候,残余的肝脏就会显著再生。再生肝除具有极强的再生能力外,另一个显著的特点就是具有很强的抗损伤能力。深入认识肝脏的生理特征,揭示再生肝抗损伤的调控机制,必将为肝脏疾病的预防和治疗提供重要的理论依据和实施策略。正常肝脏在做完2/3外科切除后,很短的时间内便进入了快速的细胞增殖阶段。不同时间点的再生肝对半乳糖胺(galactosamine , GalN)/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等肝损伤毒剂都具有一定的抗损伤能力,但已有实验证明,96小时的再生肝抗损伤能力最强。虽然半乳糖胺和脂多糖对肝细胞的损伤机制不完全相同,但它们都有一个共同的特点,就是可以使肝细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成增多。大量的活性氧自由基可以介导肝细胞的氧化损伤,参与多种肝脏疾病的病理过程,因此如何有效的对抗肝细胞生成的过多的活性氧自由基便成为提高肝脏抗损伤能力的关键问题。解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)是存在于线粒体内膜上解偶联蛋白家族的新成员之一,广泛的分布于人类和啮齿类动物的各个组织和器官中。目前,关于UCP2的生理功能还不是完全清楚,但已有实验证明UCP2的解偶联效应可以使细胞内ROS的生成减少,保护细胞免受氧化损伤。已有研究结果显示,正常的肝脏实质细胞不表达或低表达UCP2,而再生肝细胞中UCP2的表达却显著增加,因此我们推测UCP2很可能与再生肝极强的抗损伤能力有关。为此,本实验通过运用UCP2特异性体内抑制剂京尼平(genipin)来抑制其功能,首先在肝再生动物模型上,检测给予京尼平抑制的再生肝受到半乳糖胺/脂多糖联合诱导损伤后的生化指标,观察UCP2在抗损伤中的作用;其次,结合正常张氏肝细胞和UCP2过表达的张氏肝细胞,通过检测细胞线粒体膜电位和细胞内ROS含量的变化以及检测细胞存活率(MTT)的改变,在离体细胞水平上进一步观察UCP2在肝细胞抗GalN/LPS联合诱导损伤中的作用。方法:动物实验选取健康的雄性昆明小鼠,随机分为6组(n=8/组):假手术组(SO),假手术损伤组(SO + GalN/LPS),肝切组(PH),肝切损伤组(PH + GalN/LPS),肝切京尼平损伤组(PH + Genipin + GalN/LPS)和肝切京尼平组(PH + Genipin)。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后进行手术,肝切手术按Higgins和Anderson方法切除2/3肝组织。假手术组只打开腹腔,然后缝合,不实施肝切。分别在损伤前12小时和1小时,肝切京尼平损伤组和肝切京尼平组按两次给予京尼平(20mg/kg/BW,ip)。手术后96小时,假手术损伤组,肝切损伤组和肝切京尼平损伤组腹腔注射GalN(400 mg/kg/BW)和LPS(10 mg/kg/BW)。假手术组和肝切组只注射相同剂量的生理盐水。给药24小时后断头取血检测血清谷丙转氨酶(alanine amiotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平,取肝组织匀浆检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量。另取肝组织制作石蜡切片,HE染色观察肝组织形态学改变。本实验所用细胞为正常张氏肝细胞(Chang Liver)和UCP2过表达的张氏肝细胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,37℃、5%CO2恒温孵育箱培养。常规培养2-3代后,待细胞状态良好时开始进行实验。应用京尼平作为UCP2特异性抑制剂。将细胞分为四组,分别为对照组、京尼平25μM组、京尼平50μM组、京尼平100μM组。对照组正常换液,给药组分别给与不同浓度的京尼平作用40min后,用荧光分光光度法检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞内总ROS的含量。将正常的张氏肝细胞和UCP2过表达的张氏肝细胞分别均匀的种于96孔板中,待基本贴满板底时,将细胞分为五组,分别为对照组和不同GalN/LPS浓度损伤组。半乳糖胺浓度分别为0.5mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L和2mmol/L,脂多糖浓度为10mg/L。培养12小时后,运用MTT法检测细胞存活率。结果:1.动物死亡率改变半乳糖胺/脂多糖损伤24小时后,假手术损伤组死亡率最高,而肝切损伤组抗损伤能力最强,死亡率最低。经卡方检验统计,肝切损伤组与假手术损伤组相比,死亡率显著降低(P<0.05);肝切损伤组与肝切京尼平损伤组相比,死亡率降2.组织形态学改变HE染色结果显示,假手术组和肝切组细胞形态正常,中央静脉周围肝细胞索排列紧密;但假手术损伤组肝细胞索排列明显紊乱,炎性和坏死细胞增多;肝切损伤组多数肝细胞形态正常,但局部区域也有少量炎细胞浸润和肝细胞坏死;而肝切京尼平损伤组肝细胞索状排列紊乱,出现较多炎性和坏死细胞;肝切京尼平组肝细胞形态和肝细胞索排列均比较正常。3.血清转氨酶水平改变半乳糖胺/脂多糖损伤24小时后肝细胞内大量ALT、AST释放入血,血清转氨酶水平急剧增高。血清ALT水平:假手术损伤组约是假手术组的60倍(P<0.01),肝切损伤组约是肝切组的29倍(P<0.01),肝切京尼平损伤组约是肝切损伤组的1.5倍(P<0.01);血清AST水平:假手术损伤组约是假手术组的24倍(P<0.01),肝切损伤组约是肝切组的11倍(P<0.01),肝切京尼平损伤组约是肝切损伤组的1.7倍(P<0.01)。肝切损伤组血清ALT/AST水平明显低于假手术肝损伤(P<0.01),而肝切损伤组血清ALT/AST也明显低于肝切京尼平损伤组(P<0.01)。4.肝组织MDA和SOD含量改变肝切组MDA和SOD的含量与假手术组相比没有明显改变。假手术损伤组与假手术组相比,MDA含量显著增加(P<0.01),而SOD含量明显降低(P<0.05)。肝切损伤组与肝切组相比,MDA含量的增加和SOD含量的降低幅度都小于假手术损伤组与假手术组(P<0.05)。肝切京尼平损伤组与肝切损伤组相比,MDA含量显著增加(P<0.01),而SOD含量却变化不大。5.细胞膜电位和ROS水平改变给与不同浓度京尼平作用40min后,京尼平处理组与对照组相比,肝细胞线粒体膜电位和ROS水平显著升高(P<0.01),且在一定范围内具有剂量依赖性。6.细胞存活率改变给与不同浓度的半乳糖胺/脂多糖作用12小时后,UCP2过表达细胞的存活率显著高于正常肝细胞(P<0.01)。结论:1.再生肝具有很强的抗损伤能力。运用京尼平特异性抑制UCP2后,再生肝抗损伤能力明显减弱。结果提示UCP2是提高再生肝抗GalN/LPS损伤的重要因素。2.UCP2可通过下调肝细胞线粒体MMP和ROS含量,可能是肝细胞抗GalN/LPS损伤的机制之一。

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摘要 6-9Abstract 9-13前言 13-14材料与方法 14-17结果 17-24讨论 24-29结论 29-30参考文献 30-34综述 34-46 参考文献 40-46致谢 46

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