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hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34~+造血干/祖细胞增殖和分化的影响

作　者: 井莹莹
导　师: 缪竞诚；杨吉成
学　校: 苏州大学
专　业: 免疫学
关键词: 人白血病抑制因子逆转录病毒载体腺病毒载体造血干/祖细胞 SCID小鼠
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 18次
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内容摘要

目的:分别建立逆转录病毒载体和腺病毒载体介导的转人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果。方法:将本科室构建和保存的hLIF基因重组逆转录病毒载体经鉴定正确后转染293T人胚肾成纤维细胞,经抗生素Zeocin筛选后获得稳定的转基因饲养层细胞,采用RT-PCR法和ELISA法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测hLIF基因在饲养层细胞中的转录和翻译;将本科室保存的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38人胚肺成纤维细胞建立饲养层细胞,同样采用RT-PCR法和ELISA法检测hLIF基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测其纯度;将CD34+造血干/祖细胞分别与上述饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血细胞经CFDA SE(Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester,)荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,通过细胞荧光标记法和RT-PCR法检测小鼠骨髓内含Alu基因人源细胞的归巢情况。结果:建立的逆转录病毒载体介导转hLIF基因饲养层细胞经Zeocin筛选后均带有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因可以在293T细胞中有效表达;50MOI的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38细胞48h后,可见95%以上的细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定转基因细胞中有hLIF基因的表达;免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.6±2.58%,与逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞共培养7d后,细胞总数最高可扩增12.6±1.32倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为55.0%、59.3%;而Ad-hLIF转基因饲养层细胞可使CD34+造血干/祖细胞7d内扩增18.45±1.24倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为57.2%、59.8%,继续培养28d后,细胞总数扩增了356.95±0.87倍,其中CD34+细胞的数量出现了动态变化,在0~14d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低,共培养28d时,CD34+细胞数量仍比共培养前有较大升高,可扩增13.92±0.85。将扩增后的造血细胞移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法鉴定后,还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞。结论:成功建立了逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞和Ad-hLIF转基因饲养层细胞,不仅体外可以有效的扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化,而且扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有一定的造血恢复功能。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
引言  8-10
第一部分逆转录病毒载体介导的转 hLIF 基因饲养层细胞对脐血 CD34~+造血干/祖细胞的扩增作用  10-24
  1 材料与方法  10-18
  2 结果  18-22
  3 讨论  22-24
第二部分 Ad-hLIF 转基因饲养层细胞对脐血 CD34~+ 造血干/祖细胞增殖和分化的影响  24-35
  1 材料与方法  24-27
  2 结果  27-32
  3 讨论  32-35
第三部分扩增后脐血 CD34~+细胞移植亚致死剂量辐照的 SCID 小鼠的研究  35-40
  1 材料与方法  35-37
  2 结果  37-39
  3 讨论  39-40
结论  40-41
参考文献  41-47
综述：造血干/祖细胞移植研究新进展  47-54
发表和待发表的论文  54-55
本论文受下列课题资助  55-56
缩略词表  56-58
致谢  58

hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34~+造血干/祖细胞增殖和分化的影响

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