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干细胞联合血红素加氧酶-1和心肌营养素-1基因治疗急性心肌梗死的研究

作　者: 张燕
导　师: 李肖蓉；张学光
学　校: 苏州大学
专　业: 免疫学
关键词: 急性心肌梗死血红素加氧酶-1 心肌营养素-1 骨髓间充质干细胞白蛋白微泡超声大鼠
分类号: R542.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合血红素加氧酶-1(HO-1)和心肌营养素-1基因(CT-1)治疗急性心肌梗死改善心功能。方法:(1)Trizol试剂法从大鼠脾脏细胞中提取总RNA,经RT-PCR反应克隆扩增HO-1基因,与PIRES2-EGFP载体链接,构建重组真核表达载体PIRES2-EGFP/HO-1;PIRES2-EGFP/CT-1表达载体为本实验室构建保存。(2)采用全骨髓培养法体外分离培养大鼠BMSCs,观察生长特性、抗原表达等特征,MTT计数法检测其体外增殖能力。(3)用质粒大量抽提试剂盒提取质粒DNA,并进行定量;将制备好的白蛋白微泡与质粒DNA轻柔混匀,4℃静置1 h,滴加入培养液中,以直径为20 mm的超声探头采用0.75 W/cm2脉冲超声作用细胞20 sec,37℃放置5 min后以同样的条件再次作用细胞,6 h后更换新鲜的完全培养基继续培养48 h,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,流式细胞仪定量分析转染效率;转染后的细胞经台盼蓝染色检测细胞活性。(4)大鼠麻醉后,开胸结扎左冠状动脉,建立大鼠心肌梗死模型并以心电图、超声心动图和血清肌钙蛋白T的检测来判定。(5)将成功建立的大鼠心肌梗死模型40只随机分为四个治疗组:①对照组(BMSCs组,注射BMSCs至心肌梗死周边组织),n=10;②转染HO-1基因的BMSCs注射组(HO-1 + BMSCs组,注射转染HO-1基因的BMSCs至心肌梗死周边组织),n=10;③转染CT-1基因的BMSCs注射组(CT-1 + BMSCs组,注射转染CT-1基因的BMSCs至心肌梗死周边组织),n=10;④两种转基因BMSCs注射组(HO-1 + CT-1 + BMSCs组,注射两种转基因BMSCs至心肌梗死周边组织),n=10;术后20天,进行心脏超声检测以及统计学分析来评估疗效。(6)取其心脏取结扎线以下部分,固定、脱水、包埋、切片,HE染色,进行病理组织学观察;心肌组织冰冻切片后直接于荧光显微镜下观察,寻找表达EGFP的移植细胞。结果:(1)从大鼠脾脏细胞中扩增获得HO-1基因,构建真核表达载体PIRES2-EGFP/HO-1,测序正确的阳性克隆保种备用。(2)由骨髓分离得到的BMSCs呈梭形贴壁生长,台盼蓝染色显示活细胞率>95%;MTT生长曲线显示,细胞在接种后第3 d即进入对数生长期,细胞增殖活跃;运用流式细胞仪检测显示该群细胞高表达CD29(97.6%),CD44(96.5%),CD90(98.2%),低表达CD34(3.7%),CD45(6.8%)分子。(3)制作的白蛋白微泡浓度大于1.5×1011个/ml,直径为2.0-4.0μm;超声作用细胞后经台盼蓝染色法检测细胞存活率>95%;转染48 h后的BMSCs在激光共聚焦显微镜下可观察到EGFP,流式细胞仪检测转染细胞EGFP的表达效率为30.8%;转染后的细胞提取RNA,进行RT-PCR检测目的基因的表达发现,转基因组有特异性的条带,而对照组未见特异性条带。(4)心肌梗死动物模型建立后心电图ST段抬高,超声心动图可见明显的心梗区域,手术前后心功能指标统计学有显著差异;梗死后24 h的血样本肌钙蛋白T检测阳性。(5)心肌梗死治疗后20 d,超声心动图各项心功能指标进行统计学分析,结果显示:各转基因BMSCs组与对照组比较,P<0.05;转染HO-1基因和CT-1基因的BMSCs治疗组之间比较, P>0.05;两种转基因BMSCs治疗组与转染HO-1基因和CT-1基因的BMSCs治疗组之间比较,P<0.05。(6)细胞移植后20 d,心肌组织病理切片显示,正常心肌细胞有横纹,呈短圆柱型,有分支,其细胞核位于细胞中央,一般只有一个。梗死心肌组织可观察到明显的凝固性坏死区域,细胞核碎裂、溶解、消失,胞浆均质红染,间质水肿,周围有大量的炎性细胞浸润。各治疗组大鼠心肌梗死区及周边可见核蓝色深染的新生心肌细胞,瘢痕组织减少。(7)移植细胞后的心肌组织冰冻切片直接于荧光显微镜下观察,可见有少量细胞微弱表达EGFP。结论:骨髓间充质干细胞具有自我更新及多向分化的潜能,取材方便,且自体应用时无免疫排斥性,是一种良好的心肌修复种子细胞。超声介导白蛋白微泡破裂法可以有效地促进外源基因的转染。运用结扎冠状动脉法建立大鼠心肌梗死模型,方法简单可靠。移植两种转基因的BMSCs较单纯移植BMSCs对心肌梗死的大鼠心功能有明显改善,两种转基因细胞联合移植治疗效果更佳。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
研究背景  10-18
  参考文献  14-18
第一部分血红素加氧酶-1 的克隆及其表达载体的构建  18-26
  1 材料  18-19
  2 方法  19-20
  3 结果  20-22
  4 讨论  22-24
  参考文献  24-26
第二部分超声介导的白蛋白微泡破裂促进HO-1 和CT-1 转染至骨髓间充质干细胞  26-38
  1 材料  26-27
  2 方法  27-30
  3 结果  30-34
  4 讨论  34-36
  参考文献  36-38
第三部分 HO-1 和CT-1 基因转染的干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死  38-51
  1 材料  38-39
  2 方法  39-41
  3 结果  41-46
  4 讨论  46-48
  参考文献  48-51
全文总结  51-52
综述  52-58
研究生学习期间发表的文章  58-59
缩略词表  59-60
本课题的受资助情况  60-61
致谢  61-62

干细胞联合血红素加氧酶-1和心肌营养素-1基因治疗急性心肌梗死的研究

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