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牛皮杜鹃遗传多样性的研究

作　者: 杨志勇
导　师: 陈霞
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 遗传多样性 RAPD分析 ISSR分析模糊聚类分析
分类号: S567.19
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究采用RAPD技术对72株分别采自长白山四个不同海拔的牛皮杜鹃植株个体材料进行形态学区分和物种变异性和遗传多样性分析。首先对牛皮杜鹃基因组DNA的提取方法进行了改良,以获得高质量的基因组DNA,用于RAPD和ISSR分析。然后对牛皮杜鹃RAPD反应体系进行优化,建立最佳RAPD扩增体系,筛选出适合牛皮杜鹃RAPD分析的随机引物并进行PCR扩增。对样品的RAPD图谱及数据进行统计分析。此外,对样品进行了信使RNA差异研究,结果如下:(1)本试验采用改良CTAB法,成功地从新鲜和硅胶保存的牛皮杜鹃叶片中提取DNA,产率较高,OD260/OD280值为1.8-2.05范围内,符合RAPD分析的要求。通过琼脂糖凝胶电泳分析,提取的DNA质量高,完整性好。(2)优化了牛皮杜鹃RAPD和ISSR最佳反应体系:对于RAPD,PCR扩增的总体积为25μl,包括50ng的模板DNA,10xPCR buffer3.5μl,2.0mmol/L MgC12,0.2 mmol/L dNTPs,0.3μmol/L的引物,Taq酶l.5U。扩增程序为:94OC预变性4.5min,94OC变性15s,35OC退火1.5min,72OC 1.5min,45个循环后在72OC延伸10min,结束后在4OC条件下保存;对于ISSR,PCR扩增的总体积也为25μl,包括10ng的模板DNA,10xPCR buffer3.5μl,2.0mmol/L MgC12,2.0 mmol/L BSA,0.15 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L的引物,Taq酶l.0U。扩增程序为:94OC预变性4.5min,94OC变性15s,59.8OC退火1.5min,72OC 1.5min,35个循环后在72OC延伸10min,结束后在4OC条件下保存。最后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物。(3)在RAPD实验中采用优化后的反应体系对120个引物进行筛选,经过三次重复,筛选出多态性和扩增重复性好、谱带清晰且较多的20个引物。(4)利用20个筛选出的RAPD引物对牛皮杜鹃植株群体进行扩增,研究群体的遗传多样性。共产生152条谱带,其中143条为多态性带,占94.07%,平均每个引物扩增的DNA带数为7.15条,多态性带6.8条。根据扩增结果建立了个体间亲缘关系的UPGMA聚类图,将72份单株划分为4大类。(5)通过POPGENE 1.32软件的分析,获得了牛皮杜鹃群体Nei基因多样度指数和Shannon多样性信息含量指数。牛皮杜鹃植株群体内遗传多样性较高,同时,存在种群的变化,为后续研究奠定了基础。(6)尝试性的运用信使RNA差异技术,分析了牛皮杜鹃植株材料的种群具体差异分子性状,回收了差异性条带,并把ISSR试验中回收得到的差异条带共同进行了测序。结果通过对比得到和抗逆相关的几段序列。

全文目录

内容提要  7-8
第一章前言  8-21
  1.1 牛皮杜鹃种质资源与分布  8-9
  1.2 牛皮杜鹃的遗传多样性  9
  1.3 植物遗传多样性的不同水平研究  9-10
  1.4 分子标记在植物种群遗传多样性上的研究进展  10-17
    1.4.1 分子标记与遗传多样性  10-11
    1.4.2 植物种群遗传研究中的分子标记法  11-15
    1.4.3 分子标记在植物种群遗传研究中的应用  15-17
  1.5 分子标记种群遗传学参数的计算  17-18
  1.6 MRNA 差异显示技术及其应用  18-19
  1.7 本研究的目的和意义  19-21
第二章实验材料与方法  21-34
  2.1 试验材料  21
  2.2 试验方法  21-34
    2.2.1 主要试剂配制和仪器  21-22
    2.2.2 牛皮杜鹃基因组DNA 提取  22-23
    2.2.3 牛皮杜鹃总RNA 的提取  23-25
    2.2.4 模板DNA 与总RNA 纯度与浓度检测  25
    2.2.5 牛皮杜鹃RAPD 和ISSR 反应体系的建立  25-27
    2.2.6 mRNA 差异反应引物设定  27-28
    2.2.7 RT-PCR 反应  28-30
    2.2.8 琼脂糖凝胶的制备及电泳  30
    2.2.9 数据分析  30-34
第三章实验结果分析与讨论  34-46
  3.1 不同海拔的牛皮杜鹃的表现型分析  34-35
  3.2 不同海拔的牛皮杜鹃的叶片组织石蜡切片图分析  35
  3.3 改进CTAB 法提取牛皮杜鹃总DNA 的结果  35-36
  3.4 RAPD 实验的部分引物结果  36-37
  3.5 ISSR 试验的部分结果  37
  3.6 软件统计结果  37-39
    3.6.1 用POPGENE 软件算出的有关种群信息的各项指数如下  37-38
    3.6.2 牛皮杜鹃种群的遗传距离  38
    3.6.3 SP5510.0 软件对牛皮杜鹃的各项参数与环境参数的相关性分析结果  38-39
  3.7 MRNA 差异结果  39-40
  3.8 对回收后的片段序列结果与同源片段比对  40-46
第四章结论  46-52
  4.1 RAPD 和ISSR 技术在应用中的一些问题  46-49
  4.2 牛皮杜鹃种群的遗传多样性  49-51
  4.3 总结  51-52
参考文献  52-61
中文摘要  61-62
ABSTRACT  62-63
致谢  63

牛皮杜鹃遗传多样性的研究

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