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产酶溶杆菌OH11菌株摇瓶发酵条件优化和色素突变体筛选、基因克隆及特性的研究
作 者: 王云霞
导 师: 胡白石
学 校: 南京农业大学
专 业: 植物病理学
关键词: 生物防治 产酶溶杆菌OH11 发酵 培养基优化 色素突变体
分类号: S476
类 型: 硕士论文
年 份: 2008年
下 载: 115次
引 用: 2次
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内容摘要
由真菌、细菌、线虫引起的植物病害的防治一直是农业生产上非常重要的环节。多数病害的防治主要依赖于化学农药,但化学农药的大量使用容易对环境造成污染,危害人畜健康,同时造成病原菌抗性不断上升。而生物防治对环境污染极少,人畜安全,有时对某些有害生物可以达到长期抑制的作用,使用方便,近年来受到了广大的关注。产酶溶杆菌OH11菌株是一种新型的生防菌,其分类地位划分在黄单胞科,溶杆菌属。该菌富含G+C,有滑行运动,对由真菌、细菌引起的许多病害都有生防作用,应用前景广阔。为了大规模发酵,降低防治成本,本研究对OH11的摇瓶发酵条件进行了优化,并对OH11色素突变体进行了研究。采用单因素试验法对产酶溶杆菌OH11液体发酵的主要影响因子温度、转速等进行了研究,确定了最佳培养条件:温度为30℃、转速为210 r·min-1;通过正交试验以LB为基础培养基对其培养基成分在摇瓶中进行了优化。在优化条件下,发酵培养基中活菌数在72 h时达到8.5×109 CFU·mL-1,明显高于原基础培养基的结果:72 h时达到1.2×109 CFU·mL-1;并通过正交试验对摇瓶装量、发酵时间、接种量、初始pH值4种因素进行了优化,优化后的结果为:装液量40 mL/250mL,发酵时间72 h,接种量108 CFU,初始pH值7.5。并且测定了产酶溶杆菌OH11在不同条件下的存活情况。利用mariner转座子对菌株OH11进行转座诱变,成功构建了OH11的转座子插入文库。通过表型筛选,从2000多株突变株中筛选到一株色素突变株OH11-1。在LB固体和液体培养基中,OH11-1能产生黑色素。通过亚克隆的方法,我们鉴定了mariner转座子在染色体上的插入位点为hmgA基因。利用自杀载体pEX18GM,通过单交换的方式,构建了hmgA基因的插入失活突变株OH11-2,菌株OH11-2在表型上与OH11-1相一致。通过基因互补,构建了OH11-2的互补菌株OH11-3,OH11-3在表型上恢复了野生型的性状(即在固体和液体LB中不产生黑色素)。利用高效液相色谱技术(HPLC),鉴定了黑色素为尿黑酸,这一结果与序列分析的结果相一致。对色素突变株OH11-2进行了胞外酶检测,平板抑菌试验和温室试验,结果表明:(1)OH11-2降低了蛋白酶和葡聚糖酶的分泌,但不改变几丁质酶和纤维素酶的外泌;(2)OH11-2在平板上不改变对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的拮抗活性;(3)OH11-2降低了对番茄青枯病菌的生防活性。
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全文目录
摘要 7-9 ABSTRACT 9-11 引言 11-12 上篇 文献综述 12-36 第一章 植物病害生物防治 12-20 1 传统化学防治及其危害 12-14 2 生物防治 14-20 2.1 生物防治的概念 14-15 2.2 生物防治机制 15-18 2.3 生物防治的概况 18-20 第二章 产酶溶杆菌研究进展 20-22 1 产酶溶杆菌的特性 20 2 产酶溶杆菌的抗病机制 20-22 2.1 胞外水解酶 20-21 2.2 诱导抗性 21 2.3 调控基因 21-22 第三章 微生物发酵研究进展 22-30 1 发酵工艺的影响因素 22-26 1.1 培养基对发酵的影响 23 1.2 碳源对发酵的影响 23 1.3 氮源对发酵的影响 23-24 1.4 无机盐对发酵的影响 24 1.5 初始pH值对发酵的影响 24 1.6 温度对发酵的影响 24-25 1.7 溶氧对发酵的影响 25 1.8 初始接种量对发酵的影响 25 1.9 装液量对发酵的影响 25-26 2 微生物发酵优化的方法 26-30 2.1 正交试验设计 26-27 2.2 SAS统计软件分析 27-30 第四章 微生物色素的研究进展 30-36 1 植物病原真菌产生的色素的种类及其功能 31-33 1.1 黑色素 31-33 1.2 红色素 33 2 植物病原细菌产生的色素种类及功能 33-36 下篇 研究内容 36-76 第一章 产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11菌株摇瓶发酵条件及存活条件的研究 36-50 1 材料与方法 37-40 1.1 材料 37 1.2 试验方法 37-40 2 结果与分析 40-47 2.1 碳源改良 40-41 2.2 碳源、氮源改良 41-42 2.3 磷源改良 42 2.4 培养基中金属离子成分的优化选择 42-43 2.5 培养基中维生素成分的优化选择 43-44 2.6 摇瓶条件的优化 44 2.7 不同摇床转速对OH11菌株生长的影响 44-45 2.8 不同温度对OH11菌株生长的影响 45-46 2.9 LB培养基和发酵培养基的结果比较 46 2.10 OH11菌株不同存活条件下存活情况的测定 46-47 3 结论 47 4 讨论 47-50 第二章 产酶溶杆菌OH11色素突变株的筛选、基因克隆及特性研究 50-76 第一节 产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)OH11色素突变株的筛选 51-59 1 试验材料 51-52 1.1 供试菌株和质粒 51 1.2 主要试剂、仪器与培养基 51-52 2 试验方法 52-55 2.1 L.enzymongenes OH11对抗生素的耐受水平 52 2.2 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建 52 2.3 L.enzymogenes OH11色素突变株的筛选 52 2.4 L.enzymogenes OH11色素突变株中转座子插入位点的鉴定 52-55 3 试验结果与分析 55-58 3.1 L.enzymongenes OH11对抗生素耐受水平分析 55 3.2 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建及色素突变株的筛选 55-58 4 讨论 58 5 本章小结 58-59 第二节 hmgA基因的敲除及黑色素突变体的特性研究 59-76 1 试验材料 59-60 1.1 试验菌株、质粒和培养条件 59 1.2 试剂和仪器 59-60 2 试验方法 60-65 2.1 L.enzymogenes OH11中hmgA基因的定向敲除 60-62 2.2 产酶溶杆菌OH11-2互补菌株的构建 62-63 2.3 黑色素突变株的特性研究 63-64 2.4 黑色素的高效液相色谱(HPLC)鉴定 64 2.5 产酶溶杆菌胞外酶的检测 64-65 2.6 平板拮抗试验 65 2.7 温室盆栽番茄青枯病的防治 65 3 试验结果 65-73 3.1 重组质粒pEX18GM-HMGA的构建及验证 65-66 3.2 hmgA插入失活突变株的构建及验证 66-67 3.3 hmgA互补质粒的构建及互补菌株的获得 67 3.4 黑色素突变株OH11-2的生长曲线 67-68 3.5 不同氨基酸对菌株OH11-2黑色素突变株生长的影响 68-69 3.6 不同pH值,营养条件,金属离子(mn~(2+)和Zn~(2+))对黑色素产生的影响 69-71 3.7 黑色素的HPLC鉴定结果 71 3.8 色素突变株OH11-2的胞外酶检测结果 71-72 3.9 色素突变株OH11-2对水稻纹枯病菌的平板拮抗试验 72-73 3.10 色素突变株OH11-2温室盆栽对番茄青枯病的防治效果 73 4 讨论 73-74 5 本章小结 74-76 全文总结 76-78 附录一(hmgA基因) 78-81 附录二 81-82 参考文献 82-92 致谢 92
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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