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产酶溶杆菌OH11菌株摇瓶发酵条件优化和色素突变体筛选、基因克隆及特性的研究

作 者: 王云霞
导 师: 胡白石
学 校: 南京农业大学
专 业: 植物病理学
关键词: 生物防治 产酶溶杆菌OH11 发酵 培养基优化 色素突变体
分类号: S476
类 型: 硕士论文
年 份: 2008年
下 载: 115次
引 用: 2次
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内容摘要


由真菌、细菌、线虫引起的植物病害的防治一直是农业生产上非常重要的环节。多数病害的防治主要依赖于化学农药,但化学农药的大量使用容易对环境造成污染,危害人畜健康,同时造成病原菌抗性不断上升。而生物防治对环境污染极少,人畜安全,有时对某些有害生物可以达到长期抑制的作用,使用方便,近年来受到了广大的关注。产酶溶杆菌OH11菌株是一种新型的生防菌,其分类地位划分在黄单胞科,溶杆菌属。该菌富含G+C,有滑行运动,对由真菌、细菌引起的许多病害都有生防作用,应用前景广阔。为了大规模发酵,降低防治成本,本研究对OH11的摇瓶发酵条件进行了优化,并对OH11色素突变体进行了研究。采用单因素试验法对产酶溶杆菌OH11液体发酵的主要影响因子温度、转速等进行了研究,确定了最佳培养条件:温度为30℃、转速为210 r·min-1;通过正交试验以LB为基础培养基对其培养基成分在摇瓶中进行了优化。在优化条件下,发酵培养基中活菌数在72 h时达到8.5×109 CFU·mL-1,明显高于原基础培养基的结果:72 h时达到1.2×109 CFU·mL-1;并通过正交试验对摇瓶装量、发酵时间、接种量、初始pH值4种因素进行了优化,优化后的结果为:装液量40 mL/250mL,发酵时间72 h,接种量108 CFU,初始pH值7.5。并且测定了产酶溶杆菌OH11在不同条件下的存活情况。利用mariner转座子对菌株OH11进行转座诱变,成功构建了OH11的转座子插入文库。通过表型筛选,从2000多株突变株中筛选到一株色素突变株OH11-1。在LB固体和液体培养基中,OH11-1能产生黑色素。通过亚克隆的方法,我们鉴定了mariner转座子在染色体上的插入位点为hmgA基因。利用自杀载体pEX18GM,通过单交换的方式,构建了hmgA基因的插入失活突变株OH11-2,菌株OH11-2在表型上与OH11-1相一致。通过基因互补,构建了OH11-2的互补菌株OH11-3,OH11-3在表型上恢复了野生型的性状(即在固体和液体LB中不产生黑色素)。利用高效液相色谱技术(HPLC),鉴定了黑色素为尿黑酸,这一结果与序列分析的结果相一致。对色素突变株OH11-2进行了胞外酶检测,平板抑菌试验和温室试验,结果表明:(1)OH11-2降低了蛋白酶和葡聚糖酶的分泌,但不改变几丁质酶和纤维素酶的外泌;(2)OH11-2在平板上不改变对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的拮抗活性;(3)OH11-2降低了对番茄青枯病菌的生防活性。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
引言  11-12
上篇 文献综述  12-36
  第一章 植物病害生物防治  12-20
    1 传统化学防治及其危害  12-14
    2 生物防治  14-20
      2.1 生物防治的概念  14-15
      2.2 生物防治机制  15-18
      2.3 生物防治的概况  18-20
  第二章 产酶溶杆菌研究进展  20-22
    1 产酶溶杆菌的特性  20
    2 产酶溶杆菌的抗病机制  20-22
      2.1 胞外水解酶  20-21
      2.2 诱导抗性  21
      2.3 调控基因  21-22
  第三章 微生物发酵研究进展  22-30
    1 发酵工艺的影响因素  22-26
      1.1 培养基对发酵的影响  23
      1.2 碳源对发酵的影响  23
      1.3 氮源对发酵的影响  23-24
      1.4 无机盐对发酵的影响  24
      1.5 初始pH值对发酵的影响  24
      1.6 温度对发酵的影响  24-25
      1.7 溶氧对发酵的影响  25
      1.8 初始接种量对发酵的影响  25
      1.9 装液量对发酵的影响  25-26
    2 微生物发酵优化的方法  26-30
      2.1 正交试验设计  26-27
      2.2 SAS统计软件分析  27-30
  第四章 微生物色素的研究进展  30-36
    1 植物病原真菌产生的色素的种类及其功能  31-33
      1.1 黑色素  31-33
      1.2 红色素  33
    2 植物病原细菌产生的色素种类及功能  33-36
下篇 研究内容  36-76
  第一章 产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11菌株摇瓶发酵条件及存活条件的研究  36-50
    1 材料与方法  37-40
      1.1 材料  37
      1.2 试验方法  37-40
    2 结果与分析  40-47
      2.1 碳源改良  40-41
      2.2 碳源、氮源改良  41-42
      2.3 磷源改良  42
      2.4 培养基中金属离子成分的优化选择  42-43
      2.5 培养基中维生素成分的优化选择  43-44
      2.6 摇瓶条件的优化  44
      2.7 不同摇床转速对OH11菌株生长的影响  44-45
      2.8 不同温度对OH11菌株生长的影响  45-46
      2.9 LB培养基和发酵培养基的结果比较  46
      2.10 OH11菌株不同存活条件下存活情况的测定  46-47
    3 结论  47
    4 讨论  47-50
  第二章 产酶溶杆菌OH11色素突变株的筛选、基因克隆及特性研究  50-76
    第一节 产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)OH11色素突变株的筛选  51-59
      1 试验材料  51-52
        1.1 供试菌株和质粒  51
        1.2 主要试剂、仪器与培养基  51-52
      2 试验方法  52-55
        2.1 L.enzymongenes OH11对抗生素的耐受水平  52
        2.2 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建  52
        2.3 L.enzymogenes OH11色素突变株的筛选  52
        2.4 L.enzymogenes OH11色素突变株中转座子插入位点的鉴定  52-55
      3 试验结果与分析  55-58
        3.1 L.enzymongenes OH11对抗生素耐受水平分析  55
        3.2 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建及色素突变株的筛选  55-58
      4 讨论  58
      5 本章小结  58-59
    第二节 hmgA基因的敲除及黑色素突变体的特性研究  59-76
      1 试验材料  59-60
        1.1 试验菌株、质粒和培养条件  59
        1.2 试剂和仪器  59-60
      2 试验方法  60-65
        2.1 L.enzymogenes OH11中hmgA基因的定向敲除  60-62
        2.2 产酶溶杆菌OH11-2互补菌株的构建  62-63
        2.3 黑色素突变株的特性研究  63-64
        2.4 黑色素的高效液相色谱(HPLC)鉴定  64
        2.5 产酶溶杆菌胞外酶的检测  64-65
        2.6 平板拮抗试验  65
        2.7 温室盆栽番茄青枯病的防治  65
      3 试验结果  65-73
        3.1 重组质粒pEX18GM-HMGA的构建及验证  65-66
        3.2 hmgA插入失活突变株的构建及验证  66-67
        3.3 hmgA互补质粒的构建及互补菌株的获得  67
        3.4 黑色素突变株OH11-2的生长曲线  67-68
        3.5 不同氨基酸对菌株OH11-2黑色素突变株生长的影响  68-69
        3.6 不同pH值,营养条件,金属离子(mn~(2+)和Zn~(2+))对黑色素产生的影响  69-71
        3.7 黑色素的HPLC鉴定结果  71
        3.8 色素突变株OH11-2的胞外酶检测结果  71-72
        3.9 色素突变株OH11-2对水稻纹枯病菌的平板拮抗试验  72-73
        3.10 色素突变株OH11-2温室盆栽对番茄青枯病的防治效果  73
      4 讨论  73-74
      5 本章小结  74-76
全文总结  76-78
附录一(hmgA基因)  78-81
附录二  81-82
参考文献  82-92
致谢  92

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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