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灵芝属菌株特异性分子标记的研究

作　者: 许美燕
导　师: 潘迎捷；张劲松
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: DNA池灵芝 SRAP ISSR SCAR 多重PCR
分类号: S567.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

灵芝在我国已有悠久的应用历史,可用于多种疾病的治疗。近年来,灵芝的栽培生产得到迅速发展,灵芝的种质资源也在不断扩大,但是我国的灵芝生产用菌种非常混乱,存在同种异名、同名异种的现象,使得灵芝的基础科研与相关产业的发展面临许多困难。本研究的目的是寻找灵芝属菌株的特异性分子标记,建立灵芝属菌株快速、有效的检测与鉴定方法,为灵芝菌种的鉴定提供一种新的、快速准确而且费用较低的鉴定方法,为我国保护灵芝菌种的知识产权提供有效检测手段及技术标准。本实验以152株灵芝属菌株(包括128株来自中国的栽培菌株及24株国外菌株)为材料,根据本实验室已完成的ERIC-PCR亲缘聚类分析结果,把相似度水平在0.850以上的菌株构成一个DNA池,共建成48个DNA池。用SRAP引物对48个DNA池进行扩增,筛选获得1个SRAP特异性标记;用ISSR引物对48个DNA池进行扩增,筛选获得3个ISSR特异性标记。回收这些特异性条带,经克隆测序后设计了4对SCAR引物,分别为C4A/C4S,C38A/C38S,C39A/C39S,C45A/C45S(C39A/S是通过SRAP获得,另外三个是通过ISSR获得)。通过SCAR-PCR扩增验证,将SRAP标记和ISSR标记均成功的转化为特异性和稳定性更好的SCAR标记。将得到的4个SCAR标记在构成DNA池的152个菌株上验证。为了保证验证的准确性,每次都以特异性菌株为阳性对照,扩增结果显示从C4,C38,C39和C45中获得的特异性SCAR标记在实验所用的所有菌株中扩增都是只对应一个菌株,分别是G0014,G0121,G0142和G0126。说明这四个标记都是针对单一菌株的特异性分子标记。实验结果证实了SCAR特异标记在菌株快速检测鉴定中的可行性和可靠性。在筛选到的4个SCAR标记中,因有两个标记C4(777bp)和C38(774bp)片段大小只相差3bp,在琼脂糖电泳中不能区分,因此我们用筛选到的4个SCAR标记建立了两个多重PCR体系,实现了在同一个反应管内同时可检测和鉴定3个菌株的方法,该体系的建立在实际操作中可大大节省检测时间,同时还可以大大降低实验成本。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
名词缩写  10-11
一、文献综述  11-25
  1 灵芝概述  11-13
    1.1 灵芝属的分类地位及形态学特征  11
    1.2 灵芝的生活史  11
    1.3 中国灵芝的种类和自然分布状况  11-12
    1.4 灵芝的化学成分  12
    1.5 灵芝的药理活性  12-13
  2 中国灵芝生产的现状  13
  3 灵芝属分类鉴定的现状及存在的问题  13-15
  4 灵芝属的鉴定  15-21
    4.1 形态学鉴定  15-17
    4.2 拮抗反应  17
    4.3 化学成分分析  17
    4.4 同工酶技术  17-18
    4.5 分子标记技术  18-21
      4.5.1 rDNA  18-19
      4.5.2 RAPD  19-20
      4.5.3 AFLP  20-21
      4.5.4 SRAP  21
  5 多重PCR  21-22
  6 DNA池(DNA pool)扩增法及其应用状况  22-23
  7 存在的问题与研究目标  23-25
    7.1 已有的工作基础  23
    7.2 存在的问题  23
    7.3 研究的目标  23-25
二、材料与方法  25-39
  1 试验材料  25-32
    1.1 供试菌株  25-30
    1.2 供试培养基  30
      1.2.1 PDY液体培养基  30
      1.2.2 PDY固体培养基  30
      1.2.3 LB液体培养基  30
      1.2.4 LB固体培养基  30
      1.2.5 LB+AP培养基  30
      1.2.6 LB+Ap+IPTG+X-gal平板  30
    1.3 供试试剂及配制方法  30-32
      1.3.1 基因组DNA提取试剂  30-31
      1.3.2 电泳缓冲液  31
      1.3.3 ITS扩增反应试剂  31
      1.3.4 SRAP扩增反应试剂  31
      1.3.5 ISSR扩增反应试剂  31-32
      1.3.6 PCR扩增产物的回收纯化  32
      1.3.7 PCR产物的分子克隆所用试剂  32
      1.3.8 菌株特异性PCR反应试剂  32
    1.4 主要使用仪器  32
  2 实验方法  32-39
    2.1 菌丝培养及基因组DNA的提取  32-33
    2.2 DNA池的构建  33
    2.3 ITS区的PCR扩增  33
    2.4 SRAP反应  33-34
    2.5 ISSR反应  34
    2.6 PCR扩增产物的纯化及序列测定  34-36
      2.6.1 PCR扩增产物的纯化  34-35
      2.6.2 序列测定和引物设计  35-36
    2.7 SCAR-PCR反应  36
    2.8 SCAR分子标记的验证  36-39
      2.8.1 特异性验证  36-37
      2.8.2 灵敏度测试  37
      2.8.3 多重PCR的建立  37-39
三、结果与分析  39-49
  1 DNA模板质量的检验  39-40
  2 DNA池的构建  40
  3 菌株特异性分子标记的获得  40-41
  4 SCAR标记的建立  41-43
    4.1 SCAR引物的设计  41-42
    4.2 SCAR扩增结果  42-43
  5 SCAR分子标记的验证  43-49
    5.1 特异性验证  43-47
    5.2 灵敏度测试  47
    5.3 多重PCR的建立  47-49
四、讨论  49-53
  1 DNA池(DNA pool)  49
  2 SCAR标记  49-51
  3 形态学鉴定方法与SCAR鉴定方法的比较  51-53
五、结论  53-55
参考文献  55-61
附录  61-69
  附录一特异性条带的序列  61-64
  附录二 SRAP引物扩增的结果  64-69
致谢  69-71
文章发表情况  71

灵芝属菌株特异性分子标记的研究

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