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膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株检测领域的应用
作 者: 陈丹华
导 师: 曹以诚
学 校: 华南理工大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 核分枝杆菌 耐药 katG基因 rpoB基因 膜反斑点杂交 聚合酶链反应
分类号: R440
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 23次
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内容摘要
近些年来,结核病在全球表现出了死灰复燃的现象,这为预防和治疗结核病带来了巨大的挑战。特别是耐药( DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病具有分布广,传播快的特点,所以结核病已被认为是当前在全球控制传染性疾病所面临的严峻课题之一。在结核病的治疗中,所用到的一线抗结核药物主要有异烟肼( INH)、利福平( RFP)、链霉素( SM)等,因此各个国家都非常重视对耐此类药物的结核分枝杆菌的研究。在当前,对结核分枝杆菌的耐药性分析的规范方法和金标准是传统的培养方法,但是这种方法在整个检测的过程中消耗的时间特别长,因而不能有效地了解并进行正确地治疗结核病。异烟肼(INH)与利福平(RFP)是二种很高效的抗结核药物,所以一直以来都在对结核治疗中起相当重要的作用。其中耐异烟肼的产生原因是因为过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因katG基因的缺失和突变造成,常见的是第315位的丝氨酸突变为苏氨酸,这一突变导致此酶对于其底物INH的亲和性降低,使得过氧化氢酶一过氧化物酶丧失了近一半的酶活性,在所有INH耐药株中大概有50%的突变为这种形式并导致对INH高度耐药。耐利福平的产生与其核心区域rpoB基因突变有关。此区域65%-86%的突变发生在第526位由组氨酸突变为酪氨酸和第531位由丝氨酸突变为亮氨酸,而且此突变将导致对利福平的高度耐药(MIC>32ug/ml)。因此,着眼于当今已知的耐药突变位点的代表性,本研究选取katG (315)和rpoB (531)突变位点作为研究检测的对象。本研究通过对膜反向斑点杂交技术在检测结核耐药性的最佳条件的反复摸索,最终确立采用孔径为0.45μm的尼龙膜,探针的终浓度为1.5 pmol/μL,杂交温度60℃、杂交时间30 min、洗膜温度为60℃,洗膜时间20 min的条件来检测结核分枝杆菌的耐药性。并且通过实验结果显示,在此条件下应用膜反向斑点杂交技术成功地检测了结核分支杆菌耐异烟肼katG基因及耐利福平rpoB基因的突变,并且与DNA测序技术做比较,检测准确性为100%。所以膜反向斑点杂交技术以简便、快速、灵敏、特异的方式直接检测结核分支杆菌katG、rpoB基因突变,可以为临床检测结核分支杆菌的耐药性提供辅助诊断手段,为开发检测结核耐药性试剂盒奠定了实验基础。
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全文目录
摘要 5-6 ABSTRACT 6-7 缩写词表 7-11 第一章 绪论 11-26 1.1 结核分枝杆菌耐药的分子机制 11-17 1.1.1 结核病现状及结核分枝杆菌耐药性 11-13 1.1.2 结核分枝杆菌耐药的分子机制 13-15 1.1.3 结核分枝杆菌耐利福平的分子机制 15-16 1.1.4 结核分枝杆菌耐异烟肼的分子机制 16-17 1.2 结核分枝杆菌耐药性检测方法的近况 17-24 1.2.1 常规药敏试验方法 18 1.2.2 BACTEC 液体培养基法 18-19 1.2.3 噬菌体生物扩增法(Phage amplified biologically assay,PhaB) 19-20 1.2.4 DNA 测序法 20-21 1.2.5 基因芯片法 21 1.2.6 反向杂交技术 21-24 1.3 本论文的研究意义及技术路线 24-26 1.3.1 本论文的研究意义 24-25 1.3.2 本论文的技术路线 25-26 第二章 膜反向斑点杂交技术检测结核耐药性条件的优化 26-41 2.1 实验材料 26-31 2.1.1 质粒和菌株 26 2.1.2 主要药品与试剂 26-27 2.1.3 主要设备与仪器 27-28 2.1.4 溶液的配制 28-31 2.2 实验方法 31-34 2.2.1 质粒的提取 31 2.2.2 PCR 扩增 31-32 2.2.3 膜反向斑点杂交过程 32-33 2.2.4 探针的优化与设计 33 2.2.5 探针浓度的优化 33 2.2.6 最适杂交温度的优化 33-34 2.2.7 杂交时间的优化 34 2.2.8 洗膜温度的优化 34 2.2.9 杂交液盐浓度的优化 34 2.2.10 生物素标记的扩增产物浓度对杂交结果的影响 34 2.3 结果与讨论 34-40 2.3.1 质粒的电泳鉴定结果 34-35 2.3.2 PCR 扩增结果 35-36 2.3.3 探针的优化与设计结果 36 2.3.4 探针浓度的优化结果 36-37 2.3.5 最适杂交温度的优化结果 37-38 2.3.6 杂交时间的优化结果 38 2.3.7 洗膜温度的优化结果 38-39 2.3.8 杂交液盐浓度的优化结果 39-40 2.4 小结 40-41 第三章 膜反向斑点杂交检测结核的耐药性 41-53 3.1 实验材料 41-46 3.1.1 质粒和菌株 41 3.1.2 主要药品与试剂 41-42 3.1.3 主要设备与仪器 42 3.1.4 溶液配制 42-46 3.2 实验方法 46-48 3.2.1 引物及寡核苷酸探针的设计与膜的制备 46 3.2.2 质粒的提取 46-47 3.2.3 PCR 扩增 47 3.2.4 膜反向斑点杂交过程 47-48 3.3 实验结果与讨论 48-52 3.3.1 引物和寡核苷酸探针的设计结果 48 3.3.2 质粒的电泳鉴定结果 48-49 3.3.3 PCR 扩增结果 49 3.3.4 katG 基因引物的PCR 扩增敏感性结果 49-50 3.3.5 katG 基因PCR-膜反向斑点杂交探针敏感性结果 50-51 3.3.6 膜反斑点杂检测耐药结核分枝杆菌结果 51-52 3.4 小结 52-53 结论与展望 53-55 结论 53 展望 53-55 参考文献 55-59 攻读硕士学位期间取得的研究成果 59-60 致谢 60-61 答辩委员会对论文的评定意见 61
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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学
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