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宁RS-1 SSH cDNA文库构建和PGIP基因克隆及其表达载体构建

作　者: 周晓婴
导　师: 戚存扣
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: Brassica napus Sclerotinia sclerotiorum Polygalacturonase (PG) polygalacturonase inhibiting protein (PGIP) Suppression Subtractive Hybridyzation(SSH)
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

油菜(Brassica napus)是我国四大油料作物之一,菜籽油更是我国主要的食用植物油。菌核病是油菜的重要病害,它是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染植株引起的茎、枝腐烂,导致油菜产量损失。一般年份可致减产5%左右,发病严重年份可导致油菜减产30%或更多。目前,十字花科及其近缘植物中尚未找到抗菌核病基因。因此,育成的油菜品种中还没有对于菌核病表现高抗或免疫的抗病品种。由于缺乏抗病基因资源,油菜菌核病抗病育种遇到了困难,寻找与致病或抗病相关基因,无疑对菌核病的防治有着重要意义。菌核病属于真菌性病害,真菌在侵染植物时首先分泌一种多聚半乳糖醛酸酶(PG), PG对植物细胞壁的降解使其他细胞壁降解酶对其底物的攻击更加容易,并为真菌的生长和发育提供糖源。PGIP,是一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白,能够特异性识别并抑制真菌分泌的PG的活性,从而抵抗真菌的侵染。本研究以油菜中抗品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌进行研究。研究中构建了经核盘菌诱导后宁RS-1抑制消减cDNA文库；此外,克隆了宁RS-1的BnPGIP基因,构建了BnPGIP-pCABIMA组成型表达载体,并通过半定量PCR技术进行初步分析。研究内容如下：一：本研究以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,分别提取经核盘菌诱导前后的宁RS-1叶片RNA,然后纯化mRNA,反转录成cDNA,经过酶解后加接头,接着进行了两次杂交,最后构建了经核盘菌诱导后宁RS-1差异表达的抑制消减cDNA文库,其中正向消减文库是以诱导后的宁RS-1cDNA为tester,以正常的宁RS-1cDNA为driver;反向杂交文库则相反。所构建的文库重组率均达到95%,文库容量均达到2700,表明所构建的文库质量良好,能够满足下一步筛选抗菌核病基因。对随机挑取的克隆进行测序分析,获得了许多跟抗病、代谢有关的基因,如r-谷氨半胱氨酸酶基因,抗真菌蛋白基因,铁蛋白基因,ACC氧化酶基因等,为进一步展开油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定提供了重要基础。二：根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物,从宁RS-1基因

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
缩略词表  10-11
第一章文献综述  11-25
  1 油菜菌核病  11-14
    1.1 核盘菌的分类及生物学特性  11-12
    1.2 菌核病的症状及危害  12
    1.3 菌核病的侵染途径  12
    1.4 核盘菌的致病机理  12-13
    1.5 核盘菌的防治情况  13-14
  2 植物防卫反应机制  14-16
    2.1 基因对基因抗性—R基因介导  15
    2.2 过敏性反应(hypersensitive reaction,HR)  15-16
    2.3 系统获得性抗性(system acquired resistance SAR)  16
    2.4 植物抗病反应的信号传导途径  16
  3 抑制消减杂交技术  16-18
    3.1 SSH技术原理  17
    3.2 SSH的技术流程  17
    3.3 SSH技术的优缺点  17-18
    3.4 SSH技术在植物上的应用  18
  4 油菜抗病基因工程研究进展  18-20
  5 PGIP的研究进展  20-22
  6 甘蓝型油菜宁RS-1  22-23
  7 本研究的目的意义  23-25
第二章核盘菌诱导下宁RS-1 SSH文库构建  25-43
  1 实验材料  25-26
    1.1 材料  25-26
    1.2 实验中所使用的试剂  26
  2 实验方法  26-35
    2.1 取样  26
    2.2 不同方法提取甘蓝型油菜宁RS-1RNA  26-27
    2.3 核盘菌接种甘蓝型油菜宁RS-1的方法  27-28
    2.4 mRNA的纯化  28
    2.5 PCR-选择cDNA减法杂交过程  28-35
  3 结果  35-41
    3.1 关于总RNA的不同提取方法  35-36
    3.2 甘蓝型油菜宁RS-1叶片总RNA纯度和质量检测  36-37
    3.3 甘蓝型油菜宁RS-1叶片mRNA纯化电泳检测  37
    3.4 甘蓝型油菜宁RS-1 cDNA和cDNA经RsaⅠ酶切后电泳检测  37-38
    3.5 第一轮差减杂交PCR产物检测  38-39
    3.6 第二轮差减杂交PCR产物检测  39
    3.7 正向,反向差减杂交菌落PCR检测重组率和插入片段  39-40
    3.8 正向和反向杂交文库库容量的鉴定  40
    3.9 EST测序及分析  40-41
  4 讨论  41-43
    4.1 关于甘蓝型油菜宁RS-1抑制消减cDNA文库的构建  41-42
    4.2 关于EST测序分析  42-43
第三章 PGIP过表达载体构建及半定量PCR分析  43-59
  1 实验材料  44
    1.1 材料  44
    1.2 实验中所用的试剂,酶及菌株  44
  2 试验方法  44-49
    2.1 油菜PGIP基因克隆  44-47
      2.1.1 CTAB法提取甘蓝型油菜宁RS-1基因组DNA  44
      2.1.2 引物设计及目的基因的PCR扩增  44-47
    2.2 油菜PGIP基因表达分析  47
      2.2.1 RNA提取  47
      2.2.2 半定量RT-PCR  47
    2.3 油菜PGIP基因过表达载体构建  47-49
  3 结果分析  49-55
    3.1 基因组DNA的提取结果  49
    3.2 PGIP基因的克隆  49-52
    3.3 对克隆到的PGIP氨基酸序列进行分析  52
    3.4 对克隆到的PGIP进行信号肽分析  52-53
    3.5 PGIP基因半定量PCR分析  53-54
    3.6 35S启动子  54-55
    3.7 过量表达载体茵落PCR检测  55
    3.8 植物表达载体pCAMBIA-PGIP酶切验证  55
  4 讨论  55-59
第四章全文结论及创新点  59-61
  1 全文结论  59
  2 创新之处  59-61
参考文献  61-71
附录  71-73
攻读硕士学位期间已发表和待发表的论文  73-75
致谢  75

宁RS-1 SSH cDNA文库构建和PGIP基因克隆及其表达载体构建

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