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海洋链霉菌产星形孢菌素的发酵优化及产物性质初步研究
作 者: 曾文峰
导 师: 王菊芳
学 校: 华南理工大学
专 业: 发酵工程
关键词: Streptomyces sp. SCSIO1667 星形孢菌素 发酵优化 细胞死亡 抑菌圈
分类号: TQ920.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
星形孢菌素(Staurosporine,STS)是一类吲哚咔唑类生物碱,它是蛋白激酶C(Proteinkinase C,PKC)抑制剂,能够诱导细胞死亡,具有抗肿瘤活性和抗癌作用。星形孢菌素最初于1977年由霉菌staurosporeus中分离得到,后来在海洋微生物中陆续发现并表达。关于星形孢菌素发酵工艺的报道最早国内外仅限于专利,目前国内外有不少人开始研究星形孢菌素发酵工艺,但发酵成本都比较高。本研究采用的菌株为链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667,通过对链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667进行生长条件摸索实验、培养基优化实验、5L发酵罐实验、抑菌实验、细胞死亡形态观察和细胞活力实验,探讨了发酵产物星形孢菌素的发酵优化条件、细胞死亡情况和抑菌能力。生长条件摸索实验是对培养时间和温度的最适条件进行摸索。培养基优化实验包括:最适碳、氮源选择实验;培养基组分单因素实验;部分因子试验;最陡爬坡实验和响应面分析法优化发酵培养基组分。抑菌实验采用测量抑菌圈大小检测抑菌作用。细胞死亡形态通过倒置相差显微镜观察,细胞活力实验采用MTT比色法研究发酵产物对MCF7人乳腺癌细胞死亡影响。实验结果显示,30℃培养60h是海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667产星形孢菌素最适培养温度和时间;该菌分泌星形孢菌素和菌体生长相偶联,产物随菌体量增加而增加;木薯淀粉和酵母粉是培养该菌的最优碳、氮源;木薯淀粉和海盐是培养基中重要影响因子,当木薯淀粉和海盐浓度为48.64 g/L和1.13 g/L时,星形孢菌素预测最大产量为50.53±0.52μg/mL,实际产量为50.89±0.24μg/mL,其发酵水平比优化前提高了3.09倍。用5L发酵罐发酵培养海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 60h后,星形孢菌素产量达到56.96±0.71μg/mL,与摇瓶最大产量相比提高了6.07μg/mL,产量提高了12%;并且发酵产物对金葡萄球菌和大肠杆菌都有抑菌作用,但抑菌效果不同,抑菌圈直径分别为10.56±0.19 mm和9.37±0.12 mm,对金葡萄球菌抑菌作用更明显。而且发酵产物能使MCF7细胞变圆,表面出现颗粒状突起,诱导MCF7细胞死亡,并且呈时间-浓度依赖性,随着发酵产物浓度和处理时间的增加,MCF7细胞死亡率增大。在添加发酵产物24h后细胞死亡率为97.05%。
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全文目录
摘要 5-6 Abstract 6-11 第一章 绪论 11-21 1.1 海洋链霉菌 11-13 1.1.1 海洋链霉菌特点 11 1.1.2 海洋链霉菌种类及产物多样性 11-12 1.1.3 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 菌种鉴定 12 1.1.4 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 产物鉴定 12-13 1.2 星形孢菌素 13-18 1.2.1 星形孢菌素来源 13-14 1.2.2 星形孢菌素结构及理化性质 14 1.2.3 星形孢菌素生物活性 14 1.2.4 星形孢菌素目前研究情况 14-17 1.2.5 星形孢菌素类药物临床开发情况 17-18 1.3 星形孢菌素发酵培养 18-19 1.3.1 星形孢菌素发酵菌种 18 1.3.2 星形孢菌素发酵生产 18-19 1.4 本研究意义和内容 19-21 1.4.1 研究意义 19-20 1.4.2 研究内容 20-21 第二章 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 培养基优化 21-44 2.1 实验材料 21-23 2.1.1 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 21 2.1.2 主要药品与试剂 21-22 2.1.3 实验设备和材料 22-23 2.2 实验方法 23-29 2.2.1 实验用主要溶液的配制 23-24 2.2.2 HPLC 样品制备 24 2.2.3 HPLC 检测条件 24 2.2.4 星形孢菌素HPLC 标准曲线制作 24-25 2.2.5 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 种子液制备 25 2.2.6 培养基优化实验 25-29 2.2.6.1 生长条件摸索实验 25 2.2.6.2 碳源选择实验 25 2.2.6.3 氮源选择实验 25-26 2.2.6.4 培养基组分单因素实验 26-27 2.2.6.5 部分因子试验 27 2.2.6.6 最陡爬坡实验 27-28 2.2.6.7 响应面分析法实验 28-29 2.2.6.8 验证实验 29 2.3 实验结果与讨论 29-42 2.3.1 不同温度下对星形孢菌素产量的影响 29-30 2.3.2 不同温度对菌体生长的影响 30-31 2.3.3 碳源选择实验结果 31-32 2.3.4 氮源选择实验结果 32-33 2.3.5 培养基组分单因素实验结果 33-38 2.3.6 部分因子试验结果 38-39 2.3.7 最陡爬坡实验结果 39-40 2.3.8 响应分析法结果 40-42 2.3.9 验证实验结果 42 2.4 小结 42-44 第三章 海洋链霉菌STREPTOMYCES SP. SCSIO1667 5L 发酵罐试验 44-54 3.1 实验材料 44-46 3.1.1 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 44 3.1.2 主要药品与试剂 44-45 3.1.3 实验设备与材料 45-46 3.2 实验方法 46-50 3.2.1 溶液的配制 46-47 3.2.1.1 5L 发酵罐溶液 46 3.2.1.2 3,5-二硝基水杨酸比色法试剂 46-47 3.2.1.3 蒽酮比色法试剂 47 3.2.2 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 发酵罐培养 47 3.2.2.1 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 活化 47 3.2.2.2 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 种子液制备 47 3.2.2.3 海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO1667 5L 发酵罐培养 47 3.2.3 星形孢菌素检测 47-48 3.2.3.1 星形孢菌素HPLC 检测条件 47 3.2.3.2 星形孢菌素HPLC 标准曲线制作 47-48 3.2.3.3 星形孢菌素HPLC 样品制备 48 3.2.4 3,5-二硝基水杨酸比色法检测还原糖 48-49 3.2.4.1 葡萄糖标准曲线制作 48-49 3.2.4.2 3,5-二硝基水杨酸比色法检测样品还原糖 49 3.2.5 蒽酮比色法检测总糖 49-50 3.2.5.1 葡萄糖标准曲线制作 49-50 3.2.5.2 蒽酮比色法检测样品总糖 50 3.2.6 数据处理 50 3.3 实验结果和讨论 50-52 3.3.1 星形孢菌素检测分析 50-51 3.3.2 还原糖检测分析 51-52 3.3.3 总糖检测分析 52 3.4 小结 52-54 第四章 海洋链霉菌STREPTOMYCES SP. SCSIO1667 产物星形孢菌素性质研究 54-64 4.1 实验材料 54-55 4.1.1 细菌和细胞 54 4.1.2 主要药品与试剂 54-55 4.1.3 实验设备和材料 55 4.2 实验方法 55-60 4.2.1 实验用主要溶液的配制 55-56 4.2.2 细菌活化和计数 56-57 4.2.3 细胞复苏 57 4.2.4 细胞接种 57 4.2.5 发酵产物处理 57 4.2.6 星形孢菌素标准品效价检测 57-59 4.2.7 抑菌圈实验检测产物抑菌效果 59 4.2.8 细胞形态观察 59 4.2.9 MTT 比色法实验检测细胞活力 59-60 4.3 实验结果和讨论 60-63 4.3.1 产物抑菌效果检测 60 4.3.2 细胞形态变化 60-62 4.3.3 星形孢菌素诱导细胞死亡 62-63 4.4 小结 63-64 结论和展望 64-66 1. 结论 64-65 2 创新点 65 3 展望 65-66 参考文献 66-70 攻读硕士学位期间取得的研究成果 70-71 致谢 71-72 附件 72
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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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