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谷氨酸棒杆菌产L-苏氨酸重组子的构建及发酵初步研究

作　者: 吕扬勇
导　师: 郑穗平
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物制药
关键词: 谷氨酸棒杆菌基因敲除过量表达响应面苏氨酸操纵子
分类号: TQ922.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之一,已被广泛应用于食品、饲料、医药等方面。由于大肠杆菌生长迅速等原因使其成为苏氨酸的生产菌种,谷氨酸棒杆菌也可以用来生产苏氨酸。随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032基因组测序的完成,氨基酸合成相关基因调控机理的清晰,以及谷氨酸棒杆菌基因操作载体系统的完善,使得通过分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造来达到育种的想法变成现实。本文以一株具有苏氨酸结构类似物抗性菌株R102(AHVr,即解除了苏氨酸过量对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制)为出发菌株,主要研究内容及结果概括如下:(1)建立DNFB柱前衍生法测定发酵液中苏氨酸含量,并确定该方法的适宜条件。(2)利用重叠延伸PCR及谷氨酸棒杆菌基因敲除载体pk18mobsacB构建了metX、dapA基因缺失菌株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及R102ΔmetXΔdapA。以dnaE(编码DNA聚合酶)为内参基因,通过实时荧光定量PCR对基因敲除的效果进行了验证,并对重组菌进行了初步发酵试验。结果表明发酵72小时后三株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58g/L、2.38 g/L、3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%、66.3%。(3)在R102ΔmetXΔdapA基础上利用谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-T18mob2过量表达了苏氨酸操纵子及苏氨酸胞外运输基因hom-thrB(O)、thrE(E),构建了单个基因过量表达菌株R102ΔmetXΔdapA(pEC-O)、R102ΔmetXΔdapA(pEC- E)。同时对两个基因进行了两种串联方式进行表达,A:将两个基因置于同一个启动子之下构建了R102ΔmetXΔdapA(pEC-O-E)、R102ΔmetXΔdapA(pEC-E-O);B:分别在每一个基因前面加入lac启动子构建R102ΔmetXΔdapA(pEC-p-O-p-E),简写为R102ΔΔ(pEC-Box)。通过实时荧光定量PCR对基因过量表达的效果进行了验证,重组菌初步发酵结果显示苏氨酸产量为3.35g/L。(4)对产酸能力较好的重组菌R102ΔΔ(pEC-Box)的苏氨酸发酵培养基进行了响应面的优化。首先利用Plackett-Burma设计筛选对苏氨酸产量影响显著的因子:葡萄糖、硫酸铵、酶解酪素,继而采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面分析对3个显著性因素进行分析,得到优化的发酵培养基,苏氨酸产量为3.8g/L,比未优化前提高了13%。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章绪论  12-25
  1.1 引言  12
  1.2 L-苏氨酸的理化性质及用途  12-14
    1.2.1 理化性质  12-13
    1.2.2 L-苏氨酸的用途  13-14
  1.3 L-苏氨酸的生产方法  14-16
  1.4 L-苏氨酸的国内外生产现状  16-17
  1.5 L-苏氨酸微生物发酵生产及基本育种思路  17-23
    1.5.1 谷氨酸棒杆菌苏氨酸生物合成途径及调节机制  18-20
    1.5.2 L-苏氨酸产生菌育种策略及育种实例  20-23
  1.6 本文的立题背景及研究内容  23-25
第二章 L-苏氨酸测定方法的建立  25-32
  2.1 引言  25
  2.2 实验材料与仪器  25-26
    2.2.1 实验材料  25-26
    2.2.2 主要仪器与设备  26
  2.3 实验方法  26-28
    2.3.1 发酵液的获得及前处理  26-27
    2.3.2 高效液相色谱法测定发酵液中苏氨酸条件的确定  27-28
  2.4 结果与分析  28-31
    2.4.1 高效液相色谱法测定苏氨酸条件建立  28-31
  2.5 本章小结  31-32
第三章谷氨酸棒杆菌R102 分子改造对苏氨酸合成的影响  32-63
  3.1 引言  32-33
  3.2 实验材料与仪器  33-35
    3.2.1 实验材料  33-34
    3.2.2 主要仪器与设备  34-35
  3.3 实验方法  35-50
    3.3.1 细菌的培养  35
    3.3.2 谷氨酸棒杆菌敲除载体与表达载体的构建  35-44
    3.3.3 谷氨酸棒杆菌感受态细胞制备、转化及重组子筛选鉴定  44-46
    3.3.4 谷氨酸棒杆菌重组子初步发酵产苏氨酸能力比较  46
    3.3.5 实时荧光定量PCR法对敲除及过量表达基因的检测  46-50
  3.4 实验结与分析  50-62
    3.4.1 R102 结构类似物抗性验证实验结果  50-51
    3.4.2 metX、dapA 敲除载体及营养缺陷型菌株的构建  51-55
    3.4.3 hom-thrB、thrE 过量表达载体及过量表达菌株的构建  55-59
    3.4.4 几株重组菌苏氨酸产量  59-61
    3.4.5 实时荧光定量PCR法对敲除及过量表达基因的检测  61-62
  3.5 本章小结  62-63
第四章重组谷氨酸棒杆菌R102ΔΔ（pEC-Box）产苏氨酸发酵培养基的优化  63-74
  4.1 引言  63
  4.2 实验材料与仪器  63-64
    4.2.1 实验材料  63
    4.2.2 主要仪器与设备  63-64
  4.3 实验方法  64-67
    4.3.1 种子液及发酵液的获得  64
    4.3.2 Plackett-Burma设计  64-66
    4.3.3 最陡爬坡实验设计  66
    4.3.4 中心组合实验设计  66
    4.3.5 响应面模型验证  66-67
  4.4 实验结果与分析  67-72
    4.4.1 Plackett-Burma设计筛选影响显著因子  67-69
    4.4.2 最陡爬坡试验  69
    4.4.3 中心组合设计法确定显著因素的最优水平  69-72
    4.4.4 响应面模型验证  72
  4.5 本章小结  72-74
结论与展望  74-76
  结论  74-75
  本论文的创新之处  75
  展望  75-76
参考文献  76-82
攻读硕士学位期间取得的研究成果  82-83
致谢  83-84
附件  84

谷氨酸棒杆菌产L-苏氨酸重组子的构建及发酵初步研究

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