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影响蒙古牛肉质性状主要候选基因的筛选

作　者: 王峰
导　师: 张焱如
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 肉质性状 mRNA差异显示技术相对定量PCR CFL2基因
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究将以16月龄和5岁龄两个发育阶段的蒙古牛臀肌组织为实验材料,利用mRNA差异显示技术筛选与蒙古牛肉质性状密切相关的候选基因。同时采用相对定量PCR技术对不同发育阶段蒙古牛肌肉组织中差异基因的表达量进行检测。两个年龄阶段蒙古牛中获得6条差异表达片段,经测序及BLAST比对得知,其中一条片段为牛的丝切蛋白2 (cofilin2,CFL2)基因,其余5条无相似基因序列与之匹配。CFL2基因所编码的丝切蛋白2,是肌肉组织中肌动蛋白装配的调节器,该基因的选择性表达会导致牛肉嫩度发生改变,因此可以作为影响蒙古牛肉质性状的主要候选基因之一。对差异表达基因CFL2进行真实性和差异表达量检测。结果显示CFL2基因在5岁龄蒙古牛肌肉组织中的表达量是16月龄蒙古牛的3.8倍,过量的丝切蛋白2可以抑制单体型肌动蛋白的聚合及1型优质肌纤维的累积,表明该基因的高表达可能导致了蒙古牛肉质性状的下降。蒙古牛肉质性状候选基因CFL2的成功获得及其表达差异的研究,为日后培育优良肉质性状蒙古牛,生产高品质、绿色健康牛肉提供了重要的理论与实验依据。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 引言  8-15
  1.1 牛肉品质评定的主要指标  8-10
    1.1.1 感官指标  8-9
    1.1.2 内在指标  9-10
    1.1.3 加工指标  10
  1.2 影响牛肉品质的非遗传因素  10-11
    1.2.1 饲料因素  10
    1.2.2 环境因素  10-11
    1.2.3 屠宰后成熟  11
  1.3 影响牛肉质性状的主要候选基因  11-14
    1.3.1 脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding proteins, FABP）基因  11-12
    1.3.2 钙蛋白酶（calpain, CAPN）基因  12-13
    1.3.3 Leptin 基因  13
    1.3.4 其他相关基因  13-14
  1.4 立题依据及研究目的意义  14-15
2 实验一影响蒙古牛肉质性状主要候选基因的筛选  15-27
  2.1 材料  15-16
    2.1.1 主要实验仪器  15-16
    2.1.2 实验药品  16
    2.1.3 载体与菌种  16
    2.1.4 实验用主要试剂的配方  16
  2.2 方法  16-23
    2.2.1 蒙古牛肌肉样本的采集  16-17
    2.2.2 引物的设计与合成  17
    2.2.3 蒙古牛肌肉组织总 RNA 的提取  17-18
    2.2.4 不同发育阶段蒙古牛肌肉组织cDNA 池的建立  18
    2.2.5 差异表达基因的筛选  18-22
      2.2.5.1 差异 PCR 反应  18-19
      2.2.5.2 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳  19
      2.2.5.3 凝胶的染色（银染法）  19-20
      2.2.5.4 差异片段的回收  20
      2.2.5.5 二次 PCR  20-21
      2.2.5.6 二次 PCR 产物的鉴定与回收  21-22
    2.2.6 目的片段 DNA 与载体的连接  22
    2.2.7 转化感受态细胞 TOP10  22
    2.2.8 筛选阳性克隆菌  22-23
    2.2.9 阳性克隆菌的扩增与测序  23
  2.3 结果  23-26
    2.3.1 蒙古牛肌肉组织总 RNA 的提取结果  23
    2.3.2 不同发育阶段蒙古牛肌肉组织的 mRNA 差异显示结果  23-24
    2.3.3 二次 PCR 结果  24-25
    2.3.4 菌落 PCR 鉴定结果  25
    2.3.5 测序结果与序列分析  25-26
  2.4 讨论  26-27
3 实验二不同发育阶段蒙古牛肌肉组织中 CFL2 基因的差异表达  27-35
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 主要仪器设备  28
    3.1.2 主要试剂  28-29
  3.2 方法  29-31
    3.2.1 特异性引物的设计与合成  29
    3.2.2 cDNA 模板的获得  29
    3.2.3 相对定量 PCR 检测 CFL2 基因的表达差异  29-31
      3.2.3.1 相对定量 PCR 方法的建立  29-30
      3.2.3.2 CFL2 与β-actin 基因标准曲线的绘制  30
      3.2.3.3 不同发育阶段蒙古牛肌肉组织中 CFL2 基因表达差异的检测  30-31
    3.2.4 CFL2 扩增产物的鉴定  31
  3.3 结果  31-34
    3.3.1 CFL2 与β-actin 基因标准曲线绘制  31-32
    3.3.2 CFL2 与β-actin 基因相对定量PCR 溶解曲线分析  32-33
    3.3.3 相对定量 PCR 产物电泳结果  33
    3.3.4 测序结果与序列分析  33-34
    3.3.5 不同发育阶段蒙古牛肌肉组织中 CFL2 基因表达量的差异  34
  3.4 讨论  34-35
4 结论  35-36
附录  36-40
致谢  40-41
参考文献  41-45
作者简介  45

影响蒙古牛肉质性状主要候选基因的筛选

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