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不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物

作　者: 张文瑞
导　师: 谢宝贵
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 银耳芽孢农杆菌介导转化胰岛素检测 ELISA
分类号: S567.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在实验室已初步建立的农杆菌EHA105介导银耳转基因方法的基础上,以银耳潮霉素敏感菌株Tr21-01为出发菌株,通过冻融法将携带有潮霉素磷酸转移酶(Hph)基因为遗传标记及人胰岛素基因(BAC)为目的基因的质粒pBHg-BCA导入根癌农杆菌GV3101,LBA4404和AGL-1中,并进一步介导转化银耳进行研究。实验结果发现:AGL-1具有较高的转化率;GV3101转化率较低,且假阳性较高;LBA4404无抗性菌落长出。此结果表明不同的农杆菌侵染银耳芽孢能力具有差异性,且对受体侵染具有一定的特异性。本实验以农杆菌EHA105为参照菌株,对农杆菌AGL-1介导转化银耳进行研究。基于农杆菌介导转基因受诸多因素的影响,本实验从农杆菌与银耳芽孢共培养时间、银耳芽孢浓度、农杆菌浓度、诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度、转化菌株阳性比率等方面进行优化。其转化条件优化结果为:AGL-1菌液OD值为0.4～0.5,AS诱导培养浓度为250μg/mL、共培养浓度为150μg/mL,银耳芽孢浓度为10~8/mL,共培养72h转化率最高,可达500个/10~8,且阳性菌落为89%;EHA105菌液OD值为0.4～0.5,AS诱导培养浓度为200μg/mL,共培养浓度为200μg/mL,银耳芽孢浓度为10~8/mL,共培养48h转化率最高,可达380个/10~8,且阳性菌落为83%。通过比较发现AGL-1比EHA105有更高的转化率。通过上述转基因方法,我们筛选到大量转化子,随机挑选26株转化子通过ITS,Hph基因及BCA基因进行DNA水平验证,同时随机选取6株进行Hph基因和BCA基因的cDNA水平验证。实验结果表明:我们选取的转化子都为阳性菌株,并且检测到Hph基因和BCA基因的mRNA。通过对60株转基因菌株利用ELISA法对BCA目的基因进行初步检测,结果表明部分菌株可以检测到表达目的BCA基因的表达产物。进一步分析我们检测得到的有目的BCA基因表达菌株发现,其潮霉素抗性很高,大部分潮霉素抗性达350μg/mL。此结果说明目BCA基因的表达与抗性基因Hph表达存在一定关系。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
第一章前言  11-20
  1 银耳研究史  11-12
    1.1 银耳生活史  11
    1.2 银耳研究现状  11-12
      1.2.1 银耳栽培研究史  11-12
      1.2.2 银耳其他方面的研究  12
  2 农杆菌介导转基因法在真菌中的研究  12-15
    2.1 根瘤农杆菌  12
    2.2 根瘤农杆菌介导转染机制  12-13
    2.3 T-DNA 导入真菌后的存在方式  13-14
    2.4 真菌转化过程中根瘤农杆菌的选择  14-15
    2.5 农杆菌介导转化的优点  15
  3 胰岛素的研究进展  15-18
    3.1 胰岛素的结构与功能  15-16
    3.2 胰岛素提取纯化  16
    3.3 胰岛素的检测  16-17
    3.4 外源重组胰岛素的研究  17-18
  4 外源基因表达产物检测方法的研究进展  18-20
    4.1 外源基因表产物检测的方法  18
    4.2 ELISA 法检测外源基因表达产物及当前研究进展  18-20
第二章不同农杆菌介导转化银耳芽孢  20-30
  1 材料与方法  20-25
    1.1 材料  20-22
      1.1.1 供试菌株及质粒  20
      1.1.2 培养基  20-21
      1.1.3 引物  21-22
      1.1.4 碱裂解法提质粒溶液  22
      1.1.5 电泳缓冲液  22
      1.1.6 试剂  22
      1.1.7 仪器设备  22
    1.2 方法  22-25
      1.2.1 碱裂解法提取质粒  22-23
      1.2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备  23
      1.2.3 冻融法转化农杆菌  23-24
      1.2.4 农杆菌菌落PCR 验证  24
      1.2.5 不同农杆菌介导外源基因转化银耳芽孢  24-25
  2 结果与分析  25-29
    2.1 质粒转化各农杆菌  25-26
    2.2 不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳T121-01  26-29
  3 讨论  29-30
第三章农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳体系的优化  30-46
  1 材料与方法  30-32
    1.1 材料  30-31
      1.1.1 供试菌株及质粒  30
      1.1.2 培养基  30
      1.1.3 试剂  30-31
    1.2 方法  31-32
      1.2.1 AS 在农杆菌诱导培养过程中浓度  31
      1.2.2 共培养中AS 浓度在  31
      1.2.3 共培养时间  31
      1.2.4 农杆菌浓度  31-32
      1.2.5 银耳芽孢浓度  32
      1.2.6 抗性菌落中阳性转化子比率  32
  2 结果与分析  32-45
    2.1 AS 在农杆菌培养过程中诱导浓度的影响  32-36
    2.2 AS 浓度在共培养中的影响  36-39
    2.3 共培养时间  39-41
    2.4 农杆菌浓度  41-42
    2.5 银耳芽孢浓度  42-43
    2.6 抗性菌落中阳性转化子比率  43-45
  3 讨论  45-46
第四章人胰岛素基因银耳芽孢转化子验证  46-57
  1 材料与方法  46-50
    1.1 材料  46-47
      1.1.1 供试菌株及质粒  46
      1.1.2 培养基  46
      1.1.3 CTAB 法提DNA 试剂  46
      1.1.4 引物  46-47
      1.1.5 试剂  47
    1.2 方法  47-50
      1.2.1 CTAB 法提取基因组DNA  47-48
      1.2.2 基因组DNA PCR 分析  48-50
  2 结果与分析  50-56
    2.1 人胰岛素银耳转化子DNA 水平验证  50-53
      2.1.1 ITS 检测  50-52
      2.1.2 hph 基因  52
      2.1.3 人胰岛素基因BCA  52-53
    2.3 RT-PCR  53-54
    2.4 人胰岛素银耳转化菌株发酵期变异形态分析和验证  54-56
  3 讨论  56-57
第五章银耳芽孢转化菌株中人胰岛素基因表达产物的检测  57-73
  1 材料与方法  57-61
    1.1 材料  57-59
      1.1.1 供试菌株  57-58
      1.1.2 培养基  58
      1.1.3 银耳芽孢破碎缓冲液  58
      1.1.4 外源蛋白抽提缓冲液  58
      1.1.5 试剂  58-59
      1.1.6 仪器设备  59
    1.2 方法  59-61
      1.2.1 转化子潮霉素抗性梯度实验  59
      1.2.2 银耳芽孢液氮破碎法  59
      1.2.3 银耳芽孢石英砂破碎法  59-60
      1.2.4 银耳芽孢高渗酶解法  60
      1.2.5 人胰岛素表达产物抽提  60
      1.2.6 人胰素抗原的双抗体夹心法  60-61
  2 结果与分析  61-71
    2.1 转化子菌株潮霉素梯度抗性实验  61-63
    2.2 胰岛素注射液ELISA 检测  63-64
    2.3 不同银耳芽孢破碎方法对ELISA 检测结果的影响  64-65
    2.4 石英砂破碎银耳芽孢ELISA 法验证  65-66
    2.5 人胰岛素基因表达菌株ELISA 初步筛选  66-68
    2.6 外源人胰岛素基因表达菌株的重复性验证  68-70
    2.7 人胰岛素表达菌株和潮霉素抗性之间的关系分析  70-71
  3 讨论  71-73
缩略词  73-74
附录1 质粒图谱  74
附录2 DL2000Mark  74-75
附录3 启动子及基因序列  75-77
参考文献  77-83
致谢  83

不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物

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