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弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定

作　者: 杨欢欢
导　师: 魏峰；刘全
学　校: 吉林农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 弓形虫蜥蜴利什曼原虫 SAG1基因电穿孔转染筛选鉴定
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 32次
引　用: 1次
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内容摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种广泛寄生于人和动物组织有核细胞内的机会性致病原虫。虫体可侵犯人和动物机体的多种脏器,引起人兽共患的弓形虫病,在动物和人群中的感染率都非常高,给人类的健康和畜牧业生产均造成了巨大威胁。迄今为止,弓形虫的治疗,特别是针对弓形虫包囊,尚无特效药物。因此,筛选和表达有效的抗原分子,研制安全有效的弓形虫疫苗具有重要的理论研究意义和实际应用价值。蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)最初是从爬行类蜥蜴中分离到的利什曼属原虫,对蜥蜴易感,但不感染哺乳动物。由于其寄生生活方式,蜥蜴利什曼原虫能以与哺乳动物相似的翻译后修饰方式对目的蛋白进行翻译后加工,例如蛋白的糖基化,磷酸化或者异戊烯化等。此外,蜥蜴利什曼原虫作为真核表达系统还具有易培养,细胞易破碎,表达蛋白不易污染等优点。因此蜥蜴利什曼原虫作为外源蛋白的表达系统越来越受到关注。本研究利用PCR扩增技术从弓形虫RH株全基因组中扩增出长短不等的弓形虫抗原基因SAG1,将其分别克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1.利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,经G418筛选阳性克隆。表达的外源重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,证明SAG1重组蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。真核表达载体pLEXSY-neo2-SAG1构建利用PCR扩增技术从弓形虫RH株基因组中扩增出弓形虫主要表面抗原基因SAG1全长片段及截断片段,分别将其克隆进真核表达载体pLEXSY-neo2,抗原基因SAG1经序列测定分析,长片段为957bp,截短片度为650bp,与Genbank上发表的国际标准株GUY-1992-RUB株SAG1基因同源性为98%。经酶切鉴定,成功构建了真核表达载体pLEXSY-neo2-SAG1。真核表达载体pLEXSY-neo2-SAG1转染蜥蜴利什曼原虫及筛选采用电穿孔转染技术将真核表达载体导入蜥蜴利什曼原虫,表达载体经同源重组整合进宿主基因组内,阳性克隆因整合进G418抗性基因neo而能在筛选培养基中生长,未整合的虫体及阴性对照则死亡,经药物G418筛选两周,获得浑浊的阳性虫体和清澈的阴性对照。转基因蜥蜴利什曼原虫鉴定提取阳性虫体及阴性对照虫体基因组,运用SAG1特异性引物及表达载体诊断引物进行PCR鉴定,结果阳性虫体中能扩增出特异的目的条带。虫体在新鲜筛选培养基中静置培养72h后提取表达的蛋白,SDS-PAGE图中分泌型表达与胞内表达的蛋白均出现约33ku的条带,阴性对照中无目的条带,Western blotting鉴定表达蛋白均能被抗组氨酸标签的特异性单克隆抗体所识别。弓形虫主要抗原基因SAG1在蜥蜴利什曼原虫中的成功克隆与表达,获得了稳定表达弓形虫SAG1基因的蜥蜴利什曼原虫虫株,为弓形虫疫苗和诊断制剂的研制奠定了基础。也有助于拓宽对弓形虫抗原蛋白真核表达性质和特点等领域的研究。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-11
第一章前言  11-17
  1.1 弓形虫病概况  11-14
  1.2 弓形虫主要表面抗原SAG1研究进展  14-15
  1.3 蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)简介  15-16
  1.4 本研究的目的和意义  16-17
第二章表达载体pLEXSY-neo_2-SAG1的构建  17-32
  1.1 材料  17-18
  1.2 方法  18-25
  1.3 结果  25-30
  1.4 讨论  30-31
  1.5 小结  31-32
第三章表达载体pLEXSY-neo_2-SAG1电穿孔转染蜥蜴利什曼原虫及筛选  32-39
  1.1 材料  32
  1.2 方法  32-35
  1.3 结果  35-37
  1.4 讨论  37-38
  1.5 小结  38-39
第四章转基因蜥蜴利什曼原虫鉴定  39-49
  1.1 材料  39
  1.2 方法  39-43
  1.3 结果  43-46
  1.4 讨论  46-48
  1.5 小结  48-49
第五章结论  49-50
参考文献  50-55
致谢  55-56
作者简历  56

弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定

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