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本文使用大肠杆菌表达系统,表达了类芽孢杆菌中的单结构域双功能木聚糖酶xyn-E18和传染性法氏囊病病毒的非结构蛋白VP5,并通过Ni亲和层析和分子筛层析纯化得到了较高纯度和浓度的蛋白。在此基础上使用悬滴法进行了木聚糖酶和VP5蛋白的晶体生长试验,但没有得到可用于衍射的晶体。木聚糖酶能够降解转化半纤维素类生物质,在生物技术领域有着巨大的应用潜力。本实验所选木聚糖酶xyn-E18是一个单结构域双功能酶,同时具有催化木聚糖和葡聚糖水解的活性,与一般被分泌到胞外,降解环境中的木聚糖酶不同,xyn-E18是一个胞内酶,对该酶的结构研究具有一定的理论和应用价值。在本实验中,经原核表达条件优化,并通过Ni亲和层析和分子筛层析两步纯化得到了较高纯度的xyn-E18,测定具有良好的酶活。在此基础上尝试了悬滴法的晶体生长试验,经过对结晶条件的初步摸索,得到了细小微晶,有待于进一步优化晶体生长条件。鸡传染性法氏囊病是危害养鸡业的重要传染病之一。传染性法氏囊病病毒是该病的病原体,对该病毒蛋白结构的研究有利于深入了解病毒的病理学机制,促进该病的预防和治疗。VP5蛋白是病毒的非结构蛋白,非病毒复制所必需,但能够诱导细胞裂解,促进病毒粒子释放,具有细胞毒性。目前对VP5蛋白结构与功能的研究较少,尚未细致明确其生物学功能,对其结构的研究仍是空白。本实验通过分别PCR扩增VP5蛋白跨膜区两端的序列,并同时连接到载体,构建了两个敲除蛋白跨膜区序列的重组质粒(pET-vp5-fc/pET-vp5-sc)。二者在跨膜区的截取长度上略有不同,以比较不同截取片段长度对蛋白性质的影响。将重组质粒导入BL21并诱导表达,得到了可溶性表达的VP5重组蛋白,并进行了蛋白的Ni亲和层析和分子筛层析纯化。.另外尝试了晶体生长,但只得到较多土块状沉淀,有待于进一步优化。
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