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铜和铬对小球藻的致毒机理及解毒方法研究

作　者: 宋淑芳
导　师: 文岳中
学　校: 浙江大学
专　业: 环境科学
关键词: 重金属氧化损伤抗氧化酶叶绿素荧光解毒联吡啶
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

微藻能通过吸附和吸收机制清除水中的重金属,因其成本低、生长繁殖快、便于大规模养殖,已被成功用作废水处理的生物吸附介质。但高浓度的重金属也会对微藻产生影响,限制了微藻在废水处理中的应用。本文研究了重金属对藻类的毒性及致毒机理,探索了不同物质对重金属的解毒作用。主要包括以下内容：(1)利用超声破碎法、研磨法、酶法提取菠菜和普通小球藻中的叶绿体,制备了类囊体膜和PSⅡ,同时对它们从形态学和希尔活力进行了检验；研究了叶绿体对Cr(Ⅵ)的还原；比较了海藻酸钠、SBA-15等不同固定方法对叶绿体、类囊体膜和PSⅡ的影响。微藻因细胞壁的特殊成分提取叶绿体比菠菜困难,尤其是栅藻；单位叶绿素浓度的希尔活力大小：类囊体膜>>研磨法叶绿体>PSⅡ>酶法叶绿体；叶绿体的活性受保存时间影响,时间越长活力越低,但是叶绿体浓度越高,活性下降速率越慢；叶绿体可通过光还原作用将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)；不同浓度的叶绿体对Cr(Ⅵ)的转化率不同；Cr(Ⅵ)影响叶绿体的光还原能力,浓度越大,对叶绿体光合作用的损伤越大；海藻酸钠包埋后叶绿体和类囊体膜希尔活性降低,SBA-15负载后PSⅡ对Cr(Ⅵ)的光还原能力增加。(2)以Cu(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)为代表,通过测定普通小球藻和及其离体叶绿体的ROS、SOD和CAT酶活性、脂质过氧化物产物(MDA),以及叶绿素荧光参数,从氧化损伤和光合作用角度研究重金属对微藻毒性及可能机理。Cu(Ⅱ)对小球藻的生长毒性大于Cr(Ⅵ)。高浓度的Cu(Ⅱ)和Cr(Ⅵ)使小球藻受到严重氧化胁迫,抗氧化酶活性降低,PSⅡ受损,光合能力和自我保护机制减弱；低浓度的Cu(Ⅱ)和Cr(Ⅵ)未引起氧化损伤和抗氧化系统的变化,反而刺激PSⅡ启动光保护能力以增强光合活力,PSⅡ的捕光能力增强,量子产量和电子传递效率提高。离体叶绿体的ROS与Cu(Ⅱ)浓度呈现出良好的浓度-效应关系；Cr(Ⅵ)作用下,ROS的水平也与Cr(Ⅵ)的浓度呈现一定的浓度-效应关系,但变化不明显,且浓度水平远低于Cu(Ⅱ)的作用；叶绿体的Hill活性的变化规律与ROS相同,说明ROS在导致叶绿体光合作用受损中起着重要作用；Cu(Ⅱ)和Cr(Ⅵ)导致ROS的产生跟光照有关。(3)通过体外试验和藻类活体试验,探讨了不同外源物质对ROS的消除作用,为降低重金属对藻类的毒性作初步探索。联吡啶(Bpy)及其衍生物能与Cu(Ⅱ)形成金属螯合物,催化H2O2分解成H2O和O2,起到类过氧化氢酶的作用,降低了重金属引起的ROS,保护了普通小球藻的生长繁殖和光合作用活性；而Bpy及其衍生物与Cr(Ⅵ)形成的化合物没有类过氧化氢酶作用,对ROS没有清除作用,毒性反而略高Cr(Ⅵ)单独作用；Bpy本身对普通小球藻有一定生长毒性,对PSⅡ的活性和抗胁迫能力有一定影响,对ROS及其酶的影响较小；试验浓度内Bpy-COOH对普通小球藻无生长抑制作用。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章文献综述  14-34
  1.1 前言  14-15
  1.2 重金属对微藻的毒作用及机理  15-21
    1.2.1 微藻对重金属的吸收  15-16
    1.2.2 对生长的抑制作用  16
    1.2.3 对超微结构的影响  16-17
    1.2.4 对光合作用的影响  17-18
    1.2.5 对细胞的遗传毒性  18-19
    1.2.6 对细胞其他生理生化的影响  19-20
    1.2.7 细胞内的Fenton反应与活性氧  20-21
  1.3 重金属的解毒  21-27
    1.3.1 抗氧化系统  21-25
      1.3.1.1 酶途径  21-24
      1.3.1.2 非酶途径  24-25
    1.3.2 金属硫因MTs及其他解毒途径  25-27
  1.4 本课题的研究意义和内容  27
  参考文献  27-34
第二章叶绿体的分离固定及对Cr(Ⅵ)的还原  34-58
  2.1 前言  34-35
  2.2 材料与方法  35-40
    2.2.1 主要材料与试剂  35-36
    2.2.2 仪器设备  36
    2.2.3 叶绿体的分离  36-37
      2.2.3.1 超声破碎法  36
      2.2.3.2 研磨法  36
      2.2.3.4 酶法  36-37
    2.2.4 类囊体膜提取  37
    2.2.5 PSⅡ制备  37
    2.2.6 叶绿体固定  37-38
    2.2.7 细胞壁检验  38
    2.2.8 叶绿体完整性检验  38
    2.2.9 活性评价  38-39
    2.2.10 Cr(Ⅵ)还原试验  39
    2.2.11 数据分析  39-40
  2.3. 结果与讨论  40-53
    2.3.1 叶绿体的分离  40-44
      2.3.1.1 形态学  40-42
      2.3.1.2 希尔活力  42-44
    2.3.2 叶绿体对Cr(Ⅵ)的还原  44-48
    2.3.3 叶绿体、类囊体膜和PSⅡ的固定  48-53
      2.3.3.1 海藻酸钠包埋叶绿体和类囊体膜  48-49
      2.3.3.2 SBA-15负载PSⅡ  49-53
  2.4. 小结  53
  参考文献  53-58
第三章铜、铬对普通小球藻和离体叶绿体的毒性研究  58-95
  3.1 前言  58-60
  3.2 实验仪器和材料  60-61
    3.2.1 实验设备  60
    3.2.2 主要试剂  60-61
  3.3.实验方法  61-64
    3.3.1 藻种培养  61
    3.3.2 完整叶绿体提取  61
    3.3.3 酶液的提取  61
    3.3.4 普通小球藻的毒性研究  61-64
      3.3.4.1 EC_(50)测定  61-62
      3.3.4.2 叶绿素荧光特性  62
      3.3.4.3 活性氧(ROS)测定  62-63
      3.3.4.4 可溶性蛋白(TSP)的测定  63
      3.3.4.5 丙二醛(MDA)测定  63
      3.3.4.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定  63
      3.3.4.7 过氧化氢还原酶(CAT)活性测定  63-64
    3.3.5 离体叶绿体的毒性研究  64
      3.3.5.1 Hill活性测定  64
      3.3.5.2 叶绿素荧光特性研究  64
      3.3.5.3 活性氧(ROS)测定  64
    3.3.6. 数据分析  64
  3.4. 实验结果  64-84
    3.4.1 普通小球藻的毒性研究  64-81
      3.4.1.1 普通小球藻的生长抑制率和EC_(50)  64-68
      3.4.1.3 叶绿素荧光特性  68-74
      3.4.1.4 普通小球藻的活性氧  74-78
      3.4.1.5 对小球藻脂质过氧化(MAD)的影响  78-79
      3.4.1.6 对小球藻的SOD酶的影响  79-80
      3.4.1.7 对小球藻的过氧化氢酶(CAT)的影响  80-81
    3.4.2 离体叶绿体的毒性研究  81-84
      3.4.2.1 对叶绿体Hill活性的影响  81-82
      3.4.2.2 活性氧(ROS)  82-84
  3.5 讨论  84-89
  3.6 小结  89-90
  参考文献  90-95
第四章外源物质对重金属的解毒作用研究  95-134
  4.1 前言  95-96
  4.2 材料与方法  96-100
    4.2.1 仪器与试剂  96-97
      4.2.1.1 实验仪器  96
      4.2.1.2 主要试剂  96-97
    4.2.2 藻种培养  97
    4.2.3 完整叶绿体提取  97
    4.2.4 酶液的提取  97
    4.2.5 体外解毒试验研究  97-98
      4.2.5.1 H_2O_2测定  97-98
      4.2.5.2 ·OH测定  98
    4.2.6 生物体内解毒研究  98-99
      4.2.6.1 生长率测定  98
      4.2.6.2 Hill活性测定  98
      4.2.6.3 叶绿素荧光特性研究  98-99
      4.2.6.4 ROS测定  99
      4.2.6.5 可溶性蛋白(TSP)的测定  99
      4.2.6.6 丙二醛(MDA)测定  99
      4.2.6.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定  99
      4.2.6.8 过氧化氢还原酶(CAT)活性测定  99
    4.2.7 数据分析  99-100
  4.3. 结果与讨论  100-130
    4.3.1 体外解毒试验研究  100-108
      4.3.1.1 2,2-联吡啶  100-105
      4.3.1.2 壳寡糖和壳聚糖-铁  105-108
    4.3.2 生物体内解毒研究  108-130
      4.3.2.1 2,2-联吡啶  108-123
      4.3.2.2 2,2-联吡啶-5,5-二羧酸  123-130
  4.4 小结  130-131
  参考文献  131-134
第五章结论与展望  134-137
  5.1 主要结论  134-135
    5.1.1 叶绿体的分离固定及对Cr(Ⅵ)的还原  134
    5.1.2 铜、铬对普通小球藻和离体叶绿体的毒性研究  134-135
    5.1.3 外源物质对重金属的解毒作用研究  135
  5.2 未来工作展望  135-137
硕士期间论文发表情况  137

铜和铬对小球藻的致毒机理及解毒方法研究

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