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伊马替尼联合地西他滨对K562细胞的增殖抑制作用及机制研究

作 者: 阴秀峰
导 师: 马梁明
学 校: 山西医科大学
专 业: 血液内科学
关键词: 地西他滨 伊马替尼 K562 慢性粒细胞白血病 Bim
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 78次
引 用: 1次
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内容摘要


研究目的ABL酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(IM,Gleevec?)作为慢性粒细胞白血病(CML)治疗的一线用药其疗效佳,耐受性好,但针对加速期和急变期患者疗效较差并逐渐出现耐药,严重影响CML患者治疗及预后。因此寻找一种有别于酪氨酸激酶抑制剂作用机制的药物显得格外重要。甲基化是基因表观遗传学改变之一,因其可沉默抑癌基因而在肿瘤的发生发展中起重要作用。相比基因突变,甲基化为可逆性改变,甲基转移酶抑制剂可通过去甲基化而使异常沉默的基因重新表达。CML中存在多种基因异常甲基化并在疾病进展期甲基化程度增加,DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(DAC)对CML患者包括耐药患者显出初步疗效。CML细胞中促凋亡因子Bim启动子超甲基化参与该基因低表达,且IM诱导的细胞凋亡有赖于Bim的表达。近1/3 CML患者Bim表达下降,对IM敏感性差。假设DAC可使Bim启动子去甲基化,上调Bim表达,增强IM作用。该研究目的是评价小剂量DAC对CML细胞株K562的增埴抑制作用及IM联合DAC的抗白血病效应,同时探讨DAC及IM对CML致病基因BCR/ABL mRNA及促凋亡因子Bim蛋白表达的影响。研究方法培养CML细胞株K562,随机分组:空白对照组、IM单药组(0.1μmol/L、0.2μmol/L)、DAC单药组(1μmol/L、4μmol/L)、IM联合DAC (IM 0.1μmol/L+DAC 1μmol/L、IM 0.1μmol/L+ DAC 4μmol/L、IM 0.2μmol/L+ DAC 1μmol/L及IM 0.2μmol/L+DAC 4μmol/L)。评价不同浓度药物干预前及在干预24h、48h、72h后细胞抑制率、早期凋亡率、细胞周期及48 h后BCR/ABL mRNA及Bim蛋白表达。(1)四甲基偶氮唑蓝(MTT)法初筛浓度并检测药物对细胞的抑制率;(2)流式细胞术(FCM)检测细胞周期及早期凋亡率;(3)RT-PCR检测细胞BCR/ABL mRNA的表达;(4)Western blot检测Bim蛋白的表达。结果(1)单药作用或联合用药对K562细胞的抑制率单药组DAC或IM对K562细胞的增殖抑制作用呈浓度时间依赖性,72h抑制率达高峰。联合用药组DAC 4μmol/L与IM 0.2μmol/L同DAC 1μmol/L与IM 0.2μmol/L两组在48h时间点的抑制率大于24h时间点,但差异无统计学意义。联合用药组中DAC 4μmol/L与IM 0.2μmol/L联合作用抑制率最强,在48h为56.7%,72h达90.7%。DAC 1μmol/L或DAC 4μmol/L联合IM 0.2μmol/L在48 h抑制率均大于联合IM 0.1μmol/L组,但差异无统计学意义(P〉0.05)。在24h、48h、72h单药组各浓度对细胞的抑制率差别均有统计学意义(P<0.05),联合用药组两因素间交互效应有统计学意义(P<0.05)。(2)单药作用或联合用药对K562细胞增殖周期及早期凋亡的影响单药和联合用药作用于K562细胞,使细胞周期阻滞与早期凋亡在48h时间点最明显。药物作用48h后对照组S期细胞占53.323%,G1期细胞占46.629%(图1),随着药物浓度的增加,S期细胞所占比例逐渐减少,G1期细胞逐渐增多。IM 0.2μmol/L联合DAC 4μmol/L作用48h后S期细胞降至27.641%,G1期细胞逐渐增至68.863%,凋亡细胞占28.7%。单药组IM0.2μmol/L作用48h后,早期凋亡率6.7%,DAC4μmol/L作用48h后早期凋亡率3.3%,联合用药组早期凋亡率8.4%。(3)用药前后BCR/ABLmRNA表达水平的变化药物作用前K562细胞中BCR/ABL mRNA相对β-actin表达量为0.828±0.052,IM 0.2μmol/L作用48h后BCR/ABL mRNA相对表达量为0.493±0.048,DAC4μmol/L作用48h后BCR/ABL mRNA相对表达量为0.763±0.035,IM0.2μmol/L联合DAC4μmol/L作用相同时间后BCR/ABL mRNA相对表达量为0.336±0.084,单药组各浓度差异有统计学意义(P<0.05),联合用药组两因素间交互效应无统计学意义(P〉0.05)。(4)用药前后Bim蛋白表达的变化药物作用前Bim蛋白相对β-actin的表达量为0.374±0.015,单药组IM 0.2μmol/L作用48h后Bim表达为0.536±0.019,DAC 4μmol/L作用48h后Bim表达为0.649±0.011,IM 0.2μmol/L联合DAC 4μmol/L作用相同时间后Bim表达为0.884±0.008。单药组与对照组比较Bim表达水平变化有统计学差异(P<0.05)。联合用药组与对照组及单药组比较Bim表达均有统计学差异(P<0.05)。联合用药组两因素间交互效应有统计学意义(P<0.05)。结论(1)DAC对K562细胞的增殖抑制作用呈浓度时间依赖性;(2)DAC对K562细胞的增殖抑制作用可能与细胞凋亡有关,并将细胞周期阻滞于G1期,降低S期细胞所占比例并降低BCR/ABLmRNA及增加Bim的表达;(3)IM可增加Bim的表达;(4)IM联合DAC能有效抑制K562细胞增殖,其作用机制与降低BCR/ABL mRNA的表达及上调Bim蛋白的表达有关;(5)IM联合DAC是进展期、急变期、对IM不敏感、耐药患者的选择。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-11
第一章 材料和方法  11-17
  1.1 材料  11-12
  1.2 方法  12-17
第二章 结果  17-19
  2.1 MTT 法检测药物对细胞的抑制率  17
  2.2 单药或两药联合对 K562 细胞周期及凋亡的影响  17
  2.3 用药前后BCR/ABL MRNA 表达水平的变化  17
  2.4 用药前后BIM蛋白表达的变化  17-19
第三章 讨论  19-23
第四章 结论  23-24
参考文献  24-28
附表  28-31
附图  31-33
综述  33-46
  1 CML 中部分基因超甲基化  33-38
  2 CML 中部分基因低甲基化  38-40
  参考文献  40-46
作者简历  46-47
致谢  47

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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