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猪脑心肌炎病毒的分离鉴定及RT-LAMP快速检测方法的建立

作　者: 张岭岭
导　师: 孙继国
学　校: 河北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪脑心肌炎病毒分离与鉴定环介导等温扩增技术检测
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的多种脊椎动物以脑炎、心肌炎、心肌周围炎及繁殖障碍为主要临床特征的急性人畜共患传染病。临床上,脑心肌炎病毒感染最严重和最广泛的动物是猪,可引起仔猪致死性心肌炎,造成急性死亡,死亡率最高可达100%;导致怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎。人感染后可呈现轻度脑炎症状。脑心肌炎不仅给养猪业带来巨大的经济损失,同时也危害着人类的健康。本研究对河北地区发病猪场疑似猪脑心肌炎病料进行大量采集并处理,通过细胞分离,RT-PCR技术,序列测定,毒力测定及理化特性实验进行分离鉴定。实验结果:分离得到的病毒能够在BHK-21细胞上生长,细胞出现圆缩、崩解等病变; RT-PCR扩增结果与预期的片段长度一致,得到286 bp的目的片段;序列测定分析结果与预期的结果相同;该株EMCV不耐酸,对氯仿和胰蛋白酶不敏感,不耐热,该毒株在50℃,1h的条件下丧失活性。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ,LAMP)通过具有链置换特性的Bst DNA聚合酶完成靶序列的扩增,仅需恒温就能扩增DNA,并可通过核酸染料染色观察结果。对RNA病毒不需要单独进行反转录反应,可以直接在同一反应管中进行反转录和扩增(RT-LAMP)反应。本研究首次将RT-LAMP技术用于EMCV的检测中,根据GenBank公布的猪脑心肌炎病毒基因序列,对其进行序列比对,针对保守序列(6232 bp-6441 bp)筛选并验证RT-LAMP特异性引物,包括一对内引物、一对外引物。本研究对RT-LAMP反应体系及条件进行优化;对RT-LAMP方法的灵敏度和特异性以及重复性与稳定性进行了检验。实验结果表明,RT-LAMP最佳反应温度是63℃,反应时间为50 min;最佳反应体系(25μL)为:内引物(FIP和BIP)各2.5μL,外引物(F3和B3)各0.5μL, 3μL dNTPs (2.5mM),2.5μL MgCl2(25mM),2.5μL 10×Bst DNA Buffer,1.5μL Bst DNA聚合酶,2μL RNA提取物和6μL DEPC H2O;其敏感性是普通PCR的100倍;具有较高的特异性;具有很好的可重复性和稳定性。综上所述,本研究成功分离出猪脑心肌炎病毒,并命名为BD2株;并建立了一种灵敏度高、特异性好的EMCV-RT-LAMP快速检测方法。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-32
  1.1 EMC 的研究现状  10-20
    1.1.1 EMCV 的病原生物学  10-13
    1.1.2 EMCV 的致病机理  13-14
    1.1.3 EMCV 的流行病学  14-15
    1.1.4 EMC 的临床症状及病理变化  15-17
    1.1.5 EMCV 的诊断技术  17-19
    1.1.6 疫苗研究进展  19-20
  1.2 环介导等温扩增技术（LAMP 技术）  20-29
    1.2.1 LAMP 技术的概述  20
    1.2.2 LAMP 技术的特点  20-21
    1.2.3 LAMP 技术的基本原理  21-26
    1.2.4 RT-LAMP 产物的检测  26-27
    1.2.5 LAMP 技术的应用  27-29
  1.3 研究目的及意义  29
  1.4 研究内容及技术路线  29-32
    1.4.1 研究内容  29-31
    1.4.2 技术路线  31-32
2 材料  32-37
  2.1 病料及毒株  32
  2.2 细胞、菌种与质粒载体  32
  2.3 主要仪器  32-33
  2.4 实验所需主要试剂  33-34
  2.5 试验所需主要溶液及其配制  34-37
    2.5.1 细胞培养所用溶液  34-35
    2.5.2 病毒RNA 提取所用溶液  35
    2.5.3 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  35
    2.5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化所用试剂  35-37
3 方法  37-47
  3.1 猪脑心肌炎病毒的分离鉴定  37-42
    3.1.1 RT-PCR 引物设计  37
    3.1.2 病料处理  37
    3.1.3 病毒的细胞分离培养  37
    3.1.4 病毒的RT-PCR 鉴定  37-38
    3.1.5 PCR 产物的纯化与回收  38-39
    3.1.6 PCR 产物的克隆与序列测定  39-41
    3.1.7 分离毒株的毒力测定-TCID_(50) 的测定  41
    3.1.8 分离毒株的理化特性鉴定  41-42
  3.2 猪脑心肌炎病毒RT-LAMP 快速检测方法的建立  42-47
    3.2.1 总RNA 的提取  42
    3.2.2 RT-LAMP 引物设计  42-44
    3.2.3 RT-LAMP 扩增反应  44
    3.2.4 RT-LAMP 扩增产物的纯化及酶切鉴定  44-45
    3.2.5 RT-LAMP 扩增反应条件的优化  45
    3.2.6 RT-LAMP 扩增方法特异性的检测  45-46
    3.2.7 RT-LAMP 扩增方法灵敏度的检测  46
    3.2.8 RT-LAMP 扩增方法重复性和稳定性的检测  46
    3.2.9 RT-LAMP 检测方法的应用  46-47
4 结果  47-56
  4.1 猪脑心肌炎病毒的分离鉴定  47-49
    4.1.1 病毒的细胞分离培养  47
    4.1.2 细胞毒的RT-PCR 检测结果  47-48
    4.1.3 PCR 产物的克隆与序列测定  48
    4.1.4 分离毒株的毒力测定-TCID_(50) 的测定  48
    4.1.5 分离毒株的理化特性鉴定  48-49
  4.2 猪脑心肌炎病毒RT-LAMP 快速检测方法的建立  49-56
    4.2.1 RT-LAMP 扩增反应结果  49-50
    4.2.2 RT-LAMP 扩增产物的酶切鉴定  50
    4.2.3 RT-LAMP 扩增反应条件的优化  50-54
    4.2.4 RT-LAMP 扩增方法特异性的检测  54
    4.2.5 RT-LAMP 扩增方法灵敏度的检测  54-55
    4.2.6 RT-LAMP 扩增方法重复性和稳定性的检测  55
    4.2.7 RT-LAMP 检测方法的应用  55-56
5 讨论  56-59
  5.1 猪脑心肌炎病毒的分离鉴定  56
    5.1.1 疑似猪脑心肌炎病料的采集  56
    5.1.2 猪脑心肌炎病毒在BHK-21 细胞培养  56
    5.1.3 猪脑心肌炎病毒的鉴定  56
  5.2 猪脑心肌炎病毒RT-LAMP 快速检测方法的建立  56-59
    5.2.1 RT-LAMP 操作过程中假阳性问题  56-57
    5.2.2 RT-LAMP 反应体系的分析  57-58
    5.2.3 RT-LAMP 方法的进一步研究  58-59
6 结论  59-60
参考文献  60-68
附录A  68-69
在读期间发表论文  69-71
作者简介  71-72
致谢  72-73

猪脑心肌炎病毒的分离鉴定及RT-LAMP快速检测方法的建立

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