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HLA-A33分子的体外表达及鉴定

作 者: 王健
导 师: 刘思当
学 校: 山东农业大学
专 业: 基础兽医学
关键词: HLA-A33基因 稳定细胞系 原核表达 稳定表达 EV71
分类号: R392.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 7次
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内容摘要


人类白细胞抗原(HLA)是一种重要的遗传物质,是目前所知人体最复杂的多态系统。在我国人群中A33表位占A位点表位的21%,是临床中较常见的表位。根据近些年相关报道,HLA-A33表位在多种疾病的病程进展过程中起着重要作用。在我国南方以及Korea统计的结果,HLA-A33与HBV感染后慢性化有较明显的相关性;Luan-Yin Chang博士等的研究表明,HLA-A33型为EV71易感基因型;洪军等人的研究表明,HLA-A33与小儿急性淋巴细胞白血病有遗传相关性(曹海霞等2007)。本研究通过构建HLA-A33表达载体,经重组载体的鉴定、载体的转化及转染、目的蛋白的原核表达及表达水平的检测,初步研究HLA-A33分子与EV71病毒分子之间的相互作用,为研究HLA-A33在相关疾病中的致病作用和免疫机制提供理论基础和实验依据,本研究氛围两部分内容。第一部分:建立稳定表达HLA-A33分子的细胞系及其功能的相关研究。从GenBank查阅人类HLA-A33的基因序列,结合真核表达的特点,优化所得序列的密码子,并且添加必要的限制性酶切位点Nhe I、Xho I及Flag标签蛋白。通过四质粒慢病毒系统将目的基因片段整合到宿主细胞的基因组DNA上。构建的稳定细胞系通过puro筛选可稳定传代的细胞,通过IF,WB,PCR等方法鉴定细胞系。用EV71病毒感染所获得的稳定细胞系,尝试通过CoIP寻找HLA-A33与EV71之间存在相互作用的蛋白质。第二部分:HLA-A33基因在原核细胞中表达及检测。根据原核表达的特点重新优化密码子,选择pET28a作为表达载体,在序列两端添加Nco I和BamH I限制性酶切位点,通过T4连接酶将载体和序列连接,化学转化法转入大肠杆菌TOP10感受态细胞,得到大量克隆并用PCR和测序鉴定目的基因的插入情况。将重组质粒重新转化入表达菌柱BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝成像来检测HLA-A33蛋白在原核细胞内表达情况。原核表达的蛋白添加了BirA酶底物肽和链亲和素标签Streptavidin,为后续构建HLA-A33分子的tetramer四聚体提供实验基础。本实验取得了如下成果:用常用的分子克隆技术成功构建了HLA-A33的原核表达载体,实现HLA-A33蛋白在原核细胞内的高效表达,并对表达蛋白进行了检测分析;利用慢病毒系统转染法获得了HLA-A33稳定细胞系并利用稳定细胞系初步进行EV71与HLA-A33相互作用蛋白的分析。实验的成果对于HLA-A33的后续研究具有重要的理论意义并提供坚实的实验基础。

全文目录


中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1. 前言  12-35
  1.1 HLA 研究现状  12-30
    1.1.1 HLA 简述  12-13
    1.1.2 HLA 分类  13-14
    1.1.3 HLA 分型技术  14-21
      1.1.3.1 血清学分型技术  15-16
      1.1.3.2 细胞学分型技术  16
      1.1.3.3.D NA 分型技术  16-21
    1.1.4 HLA 与疾病的关系  21-24
    1.1.5 HLA 的功能  24-28
    1.1.6 临床研究现状  28-30
  1.2 HLA 与HBV 感染  30-32
  1.3 HLA 与EV71 感染  32-33
  1.4 慢病毒系统  33-35
  1.5 本研究的目的和意义  35
2. 材料与方法  35-56
  2.1 材料及试剂  35-36
    2.1.1 常用试剂及耗材  35-36
    2.1.2 仪器设备  36
  2.2 实验方法  36-56
    2.2.1 HLA-A33 原核表达载体的构建  36-43
      2.2.1.1 优化HLA-A33 基因  37-38
      2.2.1.2 设计鉴定引物  38
      2.2.1.3 扩增目的基因片段HLA-A33  38
      2.2.1.4 PCR 产物纯化  38-39
      2.2.1.5 构建pET28a-A33 克隆  39-42
      2.2.1.6 重组克隆pET28a-A33 的鉴定  42
      2.2.1.7 目的基因片段HLA-A33 在原核细胞内表达  42-43
    2.2.2 构建稳定表达HLA-A33 细胞系  43-53
      2.2.2.1 HLA-A33 基因的优化  43-44
      2.2.2.2 HLA-A33 基因的鉴定和PCR 扩增  44-45
      2.2.2.3 HLA-A33 序列鉴定  45-47
      2.2.2.4 构建稳定表达HLA-A33 基因的细胞系  47-53
    2.2.3 HLA-A33 分子与EV71 相互作用的蛋白  53-56
      2.2.3.1 易感细胞的鉴定  53-54
      2.2.3.2 病毒的扩增及纯化  54
      2.2.3.3 病毒滴度的测定(TCID50 法)  54-55
      2.2.3.4 EV71 病毒感染RD-A33 细胞  55
      2.2.3.5 免疫共沉淀  55-56
      2.2.3.6 蛋白质银染  56
      2.2.3.7 质谱分析  56
3. 实验结果  56-68
  3.1 原核表达HLA-A33  56-58
    3.1.1 HLA-A33 基因片段扩增  56-57
    3.1.2 构建pET28a-A33 表达载体  57-58
    3.1.3 诱导表达HLA-A33  58
  3.2 构建HLA-A33 稳定细胞系  58-65
    3.2.1 PCR 扩增HLA-A33 基因  58
    3.2.2 PCR 产物回收  58-59
    3.2.3 连接产物转化  59
    3.2.4 阳性克隆PCR 鉴定  59-61
    3.2.5 质粒双酶切  61-62
    3.2.6 连接反应  62
    3.2.7 假病毒包装  62-63
    3.2.8 RD 细胞puro 抗性浓度筛选  63
    3.2.9 构建稳定细胞系  63
    3.2.10 WB 检测目的蛋白表达  63-64
    3.2.11 IF 检测目的蛋白表达  64-65
  3.3 HLA-A33 与EV71 的相互作用  65-68
    3.3.1 RD 细胞的易感性鉴定  65
    3.3.2 纯化后的EV71 病毒滴度的测定  65-66
    3.3.3 EV71 感染RD-A33 细胞  66-67
    3.3.4 CoIP 凝胶银染  67-68
4. 讨论  68-71
  4.1 HLA-A33 原核细胞的表达  69
  4.2 HLA-A33 真核表达  69-71
5. 结论  71-72
参考文献  72-79
附录  79-82
致谢  82-83
个人简介及攻读学位期间发表论文  83-84
附件  84

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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