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HLA-A33分子的体外表达及鉴定
作 者: 王健
导 师: 刘思当
学 校: 山东农业大学
专 业: 基础兽医学
关键词: HLA-A33基因 稳定细胞系 原核表达 稳定表达 EV71
分类号: R392.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
人类白细胞抗原(HLA)是一种重要的遗传物质,是目前所知人体最复杂的多态系统。在我国人群中A33表位占A位点表位的21%,是临床中较常见的表位。根据近些年相关报道,HLA-A33表位在多种疾病的病程进展过程中起着重要作用。在我国南方以及Korea统计的结果,HLA-A33与HBV感染后慢性化有较明显的相关性;Luan-Yin Chang博士等的研究表明,HLA-A33型为EV71易感基因型;洪军等人的研究表明,HLA-A33与小儿急性淋巴细胞白血病有遗传相关性(曹海霞等2007)。本研究通过构建HLA-A33表达载体,经重组载体的鉴定、载体的转化及转染、目的蛋白的原核表达及表达水平的检测,初步研究HLA-A33分子与EV71病毒分子之间的相互作用,为研究HLA-A33在相关疾病中的致病作用和免疫机制提供理论基础和实验依据,本研究氛围两部分内容。第一部分:建立稳定表达HLA-A33分子的细胞系及其功能的相关研究。从GenBank查阅人类HLA-A33的基因序列,结合真核表达的特点,优化所得序列的密码子,并且添加必要的限制性酶切位点Nhe I、Xho I及Flag标签蛋白。通过四质粒慢病毒系统将目的基因片段整合到宿主细胞的基因组DNA上。构建的稳定细胞系通过puro筛选可稳定传代的细胞,通过IF,WB,PCR等方法鉴定细胞系。用EV71病毒感染所获得的稳定细胞系,尝试通过CoIP寻找HLA-A33与EV71之间存在相互作用的蛋白质。第二部分:HLA-A33基因在原核细胞中表达及检测。根据原核表达的特点重新优化密码子,选择pET28a作为表达载体,在序列两端添加Nco I和BamH I限制性酶切位点,通过T4连接酶将载体和序列连接,化学转化法转入大肠杆菌TOP10感受态细胞,得到大量克隆并用PCR和测序鉴定目的基因的插入情况。将重组质粒重新转化入表达菌柱BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝成像来检测HLA-A33蛋白在原核细胞内表达情况。原核表达的蛋白添加了BirA酶底物肽和链亲和素标签Streptavidin,为后续构建HLA-A33分子的tetramer四聚体提供实验基础。本实验取得了如下成果:用常用的分子克隆技术成功构建了HLA-A33的原核表达载体,实现HLA-A33蛋白在原核细胞内的高效表达,并对表达蛋白进行了检测分析;利用慢病毒系统转染法获得了HLA-A33稳定细胞系并利用稳定细胞系初步进行EV71与HLA-A33相互作用蛋白的分析。实验的成果对于HLA-A33的后续研究具有重要的理论意义并提供坚实的实验基础。
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全文目录
中文摘要 8-10 ABSTRACT 10-12 1. 前言 12-35 1.1 HLA 研究现状 12-30 1.1.1 HLA 简述 12-13 1.1.2 HLA 分类 13-14 1.1.3 HLA 分型技术 14-21 1.1.3.1 血清学分型技术 15-16 1.1.3.2 细胞学分型技术 16 1.1.3.3.D NA 分型技术 16-21 1.1.4 HLA 与疾病的关系 21-24 1.1.5 HLA 的功能 24-28 1.1.6 临床研究现状 28-30 1.2 HLA 与HBV 感染 30-32 1.3 HLA 与EV71 感染 32-33 1.4 慢病毒系统 33-35 1.5 本研究的目的和意义 35 2. 材料与方法 35-56 2.1 材料及试剂 35-36 2.1.1 常用试剂及耗材 35-36 2.1.2 仪器设备 36 2.2 实验方法 36-56 2.2.1 HLA-A33 原核表达载体的构建 36-43 2.2.1.1 优化HLA-A33 基因 37-38 2.2.1.2 设计鉴定引物 38 2.2.1.3 扩增目的基因片段HLA-A33 38 2.2.1.4 PCR 产物纯化 38-39 2.2.1.5 构建pET28a-A33 克隆 39-42 2.2.1.6 重组克隆pET28a-A33 的鉴定 42 2.2.1.7 目的基因片段HLA-A33 在原核细胞内表达 42-43 2.2.2 构建稳定表达HLA-A33 细胞系 43-53 2.2.2.1 HLA-A33 基因的优化 43-44 2.2.2.2 HLA-A33 基因的鉴定和PCR 扩增 44-45 2.2.2.3 HLA-A33 序列鉴定 45-47 2.2.2.4 构建稳定表达HLA-A33 基因的细胞系 47-53 2.2.3 HLA-A33 分子与EV71 相互作用的蛋白 53-56 2.2.3.1 易感细胞的鉴定 53-54 2.2.3.2 病毒的扩增及纯化 54 2.2.3.3 病毒滴度的测定(TCID50 法) 54-55 2.2.3.4 EV71 病毒感染RD-A33 细胞 55 2.2.3.5 免疫共沉淀 55-56 2.2.3.6 蛋白质银染 56 2.2.3.7 质谱分析 56 3. 实验结果 56-68 3.1 原核表达HLA-A33 56-58 3.1.1 HLA-A33 基因片段扩增 56-57 3.1.2 构建pET28a-A33 表达载体 57-58 3.1.3 诱导表达HLA-A33 58 3.2 构建HLA-A33 稳定细胞系 58-65 3.2.1 PCR 扩增HLA-A33 基因 58 3.2.2 PCR 产物回收 58-59 3.2.3 连接产物转化 59 3.2.4 阳性克隆PCR 鉴定 59-61 3.2.5 质粒双酶切 61-62 3.2.6 连接反应 62 3.2.7 假病毒包装 62-63 3.2.8 RD 细胞puro 抗性浓度筛选 63 3.2.9 构建稳定细胞系 63 3.2.10 WB 检测目的蛋白表达 63-64 3.2.11 IF 检测目的蛋白表达 64-65 3.3 HLA-A33 与EV71 的相互作用 65-68 3.3.1 RD 细胞的易感性鉴定 65 3.3.2 纯化后的EV71 病毒滴度的测定 65-66 3.3.3 EV71 感染RD-A33 细胞 66-67 3.3.4 CoIP 凝胶银染 67-68 4. 讨论 68-71 4.1 HLA-A33 原核细胞的表达 69 4.2 HLA-A33 真核表达 69-71 5. 结论 71-72 参考文献 72-79 附录 79-82 致谢 82-83 个人简介及攻读学位期间发表论文 83-84 附件 84
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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