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芽胞杆菌诱变育种铜绿假单胞菌PAO1菲萘降解相关研究
作 者: 李兆格
导 师: 沈立新
学 校: 西北大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 芽孢杆菌 紫外诱变 发酵条件 多环芳烃 铜绿假单胞菌PAOI 降解途径
分类号: X172
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 68次
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内容摘要
由于细菌耐药性的普遍存在,且人类已经严重依赖抗生素,因此开发新型抗生素或抗生索替代产品的需求比以任何时候更迫切。本实验室人员从辣椒植株表皮下分离得到一株芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),前期研究已初步证实从该菌株培养液中提取出的活性成分中可能含有一种新型抗菌物质,但由于该抗菌物质产量太低且在发酵过程中产生多糖较多,不利于工业生产及后续的分离提取工作的进行。本实验的研究内容之一是采用紫外诱变的方法选育抗菌物质高产、多糖低产菌株。首先,通过观察比较诱变菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,从1.0×105个诱变菌株中筛选得到30株产抗抗菌物质增加的菌株,经复筛得到1株抑菌性最强的优势菌株。将优势菌株进行第二轮紫外诱变,通过观察菌落形态,从1.2×105个诱变菌株中筛选出12株菌落形态扁平的菌株,即希望为多糖分泌减少的菌株,通过测定诱变菌株培养液中多糖含量及其萃取成分对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,最终筛选出2株抗菌物质产量增加且多糖分泌减少的目标菌株,经传代培养该菌株性状稳定。随后对目标菌株进行了发酵条件优化,包括发酵时间、温度、pH及溶氧量。实验结果表明最佳发酵条件为:发酵时间为60 h、温度为30℃、pH为6.5、摇床转速为200 r/min.本研究内容为该抗菌物质进入工业生产打下了坚实的基础。多环芳烃是一类环境中广泛存在的稠环类芳香族化合物,具有致癌、致畸和潜在的致突变作用,给人类健康和环境构成了极大威胁。微生物降解是自然界中消除多环芳烃的主要方式,在已分离到的多环芳烃降解菌株中以假单胞菌属居多,但关于铜绿假单胞菌PAO1降解菲、萘的研究目前仍鲜有报道。本实验的研究内容之二是以本实验室保存的铜绿假单胞菌PAO1为出发菌株,研究其降解菲、萘的代谢途径及降解基因。首先以多环芳烃降解过程中的重要中间产物水杨酸、邻苯二甲酸为唯一碳源观察PAO1生长情况,并应用薄层层析、高效液相色谱法证实其降解中间产物的存在,最终证实PAO1在降解菲的过程中可能存在水杨酸途径和邻苯二甲酸途径,在降解萘的过程中可能存在水杨酸途径。随后研究了菲、萘降解相关基因对PAO1降解菲、萘的影响。实验室前期已通过筛选PAO1随机启动子库,获得菲、萘降解相关基因20个,本实验选取启动子表达受菲、茶影响较为显著的两个基因PA2666、PA4008为研究对象,应用基因敲除的方法构建突变体,证实了基因PA2666、PA4008在不同程度上影响PAO1对菲、萘的降解。为了进一步发现菲、萘降解关键基因,深入研究其代谢途径,本实验通过转座突变的方法构建了包含5000个克隆的转座突变体库,随后筛选在以菲、萘为唯一碳源和能源的MM平板上不能生长的菌株,得到23株阳性克隆,在后续实验中将通过随机PCR、测序及序列比对确定可能的菲、萘降解关键基因。突变体库的构建及阳性克隆的研究正在进行中本研究内容不仅促进了其它多环芳烃降解途径的研究,而且推动了多环芳烃降解菌株在环境治理方面的应用。
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全文目录
摘要一 3-4 Abstract one 4-5 摘要二 5-6 Abstract two 6-12 第一部分 芽抱杆菌诱变育种 12-34 第一章 绪论 13-19 1.1 抗生素的发现及应用 13 1.2 抗生素耐药性 13-18 1.2.1 抗生素耐药性的产生及现状 13-15 1.2.2 抗生素的耐药机理 15-16 1.2.3 产生抗生素耐药性的人为原因 16-17 1.2.4 应对抗生素耐药性的措施 17-18 1.3 新抗生素和抗生素替代品的开发研究 18 1.4 本课题的研究内容和意义 18-19 第二章 实验材料与方法 19-24 2.1 菌株 19 2.2 培养基及试剂 19 2.3 仪器 19-20 2.4 试验方法 20-24 2.4.1 生长曲线的测定 20 2.4.2 菌落形成单位的测定 20 2.4.3 菌悬液制备及最佳诱变时间的确定 20 2.4.4 紫外诱变过程 20-21 2.4.5 抑菌实验复筛诱变菌株 21 2.4.6 滤纸片法抑菌实验复筛诱变菌株 21 2.4.7 第二轮紫外诱变 21-22 2.4.8 葡萄糖标准曲线的测定 22 2.4.9 多糖含量的测定 22 2.4.10 筛选最佳突变体 22-23 2.4.11 发酵条件的优化 23-24 第三章 实验结果与讨论 24-33 3.1 芽孢杆菌生长曲线 24 3.2 最佳诱变时间的确定 24-25 3.3 诱变菌株的初筛选 25-26 3.4 复筛诱变菌株 26 3.5 第二轮紫外诱变 26-27 3.6 复筛第二轮诱变菌株 27 3.7 多糖含量测定结果 27-29 3.8 最佳诱变菌株的确定 29-30 3.9 发酵条件的优化 30-33 3.9.1 发酵时间对活性成分产量影响 30 3.9.2 培养基初始pH对活性成分产量影响 30-31 3.9.3 发酵温度对活性成分产量影响 31-32 3.9.4 发酵摇床转速对活性成分产量影响 32-33 小结 33-34 第二部分 铜绿假单胞菌PAO1菲、萘降解相关研究 34-67 第一章 绪论 35-43 1.1 环境中多环芳烃污染物的来源及现状 35-36 1.2 多环芳烃的微生物降解 36-42 1.2.1 降解多环芳烃的微生物种类 36 1.2.2 多环芳烃的生物降解机理 36-38 1.2.3 多环芳烃的降解途径 38-40 1.2.4 影响多环芳烃生物降解的因素 40-42 1.3 生物修复在多环芳烃污染治理方面的应用 42 1.4 本课题的研究内容和意义 42-43 第二章 实验材料和方法 43-54 2.1 菌株及质粒 43 2.2 培养基与试剂 43-44 2.3 主要实验仪器 44 2.4 试验方法 44-54 2.4.1 以水杨酸、邻苯二甲酸为唯一碳源研究菲、萘降解途径 44 2.4.2 菲、萘降解重要中间产物的鉴定方法 44-45 2.4.3 随机启动子库的筛选及菲、萘降解相关基因的确定 45 2.4.4 质粒的快速提取 45-46 2.4.5 质粒或DNA片段的酶切 46 2.4.6 聚合酶链式反应 46-47 2.4.7 豁性末端连接 47 2.4.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 47-48 2.4.9 电转化 48 2.4.10 蓝白筛选 48-49 2.4.11 三亲株杂交试验 49 2.4.12 基因敲除实验过程 49-51 2.4.13 突变体表型测定 51 2.4.14 绿脓菌素含量的测定 51 2.4.15 随机转座突变 51-52 2.4.16 复筛突变体 52-54 第三章 实验结果与讨论 54-66 3.1 以水杨酸、邻苯二甲酸为唯一碳源研究菲、萘降解途径 54-55 3.2 菲、萘降解重要中间产物的鉴定 55-57 3.3 铜绿假单胞菌PAO1随机启动子库筛选 57-58 3.3.1 PAO1随机启动子库的筛选及相关基因的确定 58 3.4 菲、萘降解相关基因的研究 58-65 3.4.1 PA2666突变体的验证及其表型研究 59-63 3.4.2 PA4008突变体的验证及其表型研究 63-65 3.5 随机转座突变体库的构建 65 3.6 随机转座突变体库的筛选 65-66 小结 66-67 参考文献 67-72 致谢 72
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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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