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辣椒疫霉病生防芽孢杆菌快速筛选及菌株B006的代谢活性物质研究

作　者: 索雅丽
导　师: 朱宝成；郭荣君
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 辣椒疫霉生防菌株脂肽类抗生素 surfactin HPLC-MS
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

该论文通过对芽孢杆菌生物膜能力的检测,生防功能基因的扩增,室内幼胚感病率法评价其防病效果及温室防病效果的验证,建立了一种防止辣椒疫霉病生防芽孢菌的快速筛选方法,并对高效菌株菌株B006产生的脂肽类抗生物质surfactin进行了一系列的研究,具体结果如下:首先采用聚丙烯酰胺管挂壁方法测定了实验室保存的93株芽孢菌产生生物膜的能力,获得48株产生生物膜菌株,采用生防功能基因srfAA、srfAB、ituC和fenD特异引物相对应的功能基因进行了扩增。并以辣椒疫霉为目标病原菌,采用幼胚感病率法对上述有生物膜且/或可扩增到生防功能基因的菌株进行室内的防病效果评价,获得防效50%以上的菌株15株。对其中生物膜产生级别、功能基因和室内防效不同的8株菌进行温室防病效果的评价,并对上述结果进行综合分析,结果表明生物膜为3级,可扩增到基因srfAA、srfAB、fenD,幼胚感病率法筛选中防效较好的菌株,温室防病效果也较好,防治效果可达70%以上;生物膜为2级,可扩增到srfAA、srfAB、ituC和fenD基因片段的菌株,幼胚感病率法评价结果与温室防病效果基本一致,从而建立了生物膜的检测,功能基因的扩增及幼胚感病率法评价相结合的生防芽孢杆菌的快速筛选方法,该方法对其他病害生防菌的筛选具有一定的借鉴意义。平板拮抗测定表明:温室实验中选取的8株芽孢杆菌对辣椒疫霉病菌和黄瓜枯萎病菌均有显著的抑制作用,但菌株B006的粗提品和发酵液对黄瓜枯萎病菌的抑制作用明显好于对辣椒疫霉病菌的抑制作用。HPLC-MS检测表明,芽孢杆菌B006的粗提品中可以检测到surfactin和fengycin,其中surfactin含量比较高。通过比较菌株B006在KMB、NA、SWB和Landy培养液中surfactin含量,发现培养液KMB利于surfactin的产生,对芽孢杆菌B006在KMB培养液中不同培养时间的surfactin的HPLC-MS检测表明,培养72h时surfactin产量最高。通过使用固相萃取柱(SPE)对KMB培养液的发酵液样品进行浓缩和提纯,研究了SPE柱不同淋洗条件下对surfactin提取影响,结果表明淋洗液甲醇与水的体积比为1:1时surfactin的提取效果好于体积比为95:5的提取效果;采用体外添加发酵液于灭菌土中再提取回收的方法研究了土壤对surfactin吸附作用的影响,发现土壤的吸附作用对surfactin提取的影响不明显。对灌根法和基质中添加B006菌剂培育辣椒植株,对根上surfactin的HPLC-MS检测表明,辣椒根的鲜重在3g以上时可检测到surfactin,而未接种菌剂的对照中未检测到surfactin。接种B006菌剂处理的辣椒植株发病率低于未接生防菌的辣椒植株。分别接种菌剂B006一次和二次的辣椒植株发病率为5.3%和7.5%,对照发病率为35%。本研究为辣椒疫霉病生防菌的快速筛选及抗生素surfactin在芽孢菌B006的生防机理中的作用提供了依据。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章引言  9-18
  1.1 辣椒疫病病害  9-10
    1.1.1 辣椒疫病概述  9
    1.1.2 辣椒疫霉病的发病症状  9
    1.1.3 辣椒疫病防治及存在的问题  9-10
  1.2 生防细菌概述  10-12
    1.2.1 生防芽孢杆菌  10-11
    1.2.2 生防芽孢细菌对植物病原物的作用机制  11
    1.2.3 生防芽孢细菌在植病生防上应用的前景  11-12
  1.3 芽孢杆菌活性物质的研究  12-16
    1.3.1 脂肽类抗生素概述  12-13
    1.3.2 脂肽类抗生素的分离、提纯和鉴定  13
    1.3.3 脂肽类抗生素Surfactin 和Iturin 及Fengycin 的基因结构  13-15
    1.3.4 脂肽类抗生素在植物根际的作用  15-16
    1.3.5 脂肽类抗生素与拮抗菌的筛选  16
  1.4 研究的目的和意义  16-18
第二章辣椒疫霉病生防芽孢杆菌的快速筛选  18-27
  2.1 材料  18
    2.1.1 菌株来源  18
    2.1.2 培养基  18
  2.2 实验方法  18-21
    2.2.1 芽孢细菌产生生物膜的检测  18-19
    2.2.2 芽孢杆菌生防功能基因srfAA，srfAB，ituC，fenD 的扩增  19
    2.2.3 幼胚感病率法测定芽孢杆菌对辣椒疫霉病菌的拮抗能力  19-20
    2.2.4 生物膜级别和功能基因不同的生防菌对辣椒疫霉病的温室防效评价  20-21
  2.3 结果与分析  21-26
    2.3.1 芽孢杆菌生物膜筛选结果  21
    2.3.2 芽孢杆菌的脂肽类抗生素编码基因的扩增  21-22
    2.3.3 幼胚感病率法测定芽孢杆菌对辣椒疫霉病菌的拮抗能力  22-24
    2.3.4 生物膜级别和功能基因不同的芽孢杆菌对辣椒疫霉病的温室防病效果评价  24-25
    2.3.5 芽孢杆菌防病效果与生物膜级别和功能基因的关系分析  25-26
  2.4 讨论  26-27
第三章芽孢杆菌B006 产生的脂肽类抗生素的特性研究  27-35
  3.1 材料  27
    3.1.1 菌株  27
    3.1.2 培养基  27
    3.1.3 药品试剂  27
  3.2 实验方法  27-29
    3.2.1 8 株芽孢菌对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的拮抗作用  27-28
    3.2.2 芽孢杆菌B006 抗生素粗提品抑菌作用  28
    3.2.3 芽孢杆菌B006 菌株抗生素的薄层色谱分析  28
    3.2.4 培养基对芽孢杆菌B006 产生surfactin 量的影响  28-29
    3.2.5 培养时间对芽孢杆菌B006 产生surfactin 量的影响  29
  3.3 结果与分析  29-33
    3.3.1 8 株芽孢菌对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的拮抗作用  29
    3.3.2 芽孢杆菌B006 抗生素粗体品的抑菌作用  29-31
    3.3.3 菌株 B006 抗生素薄层色谱分析结果  31-32
    3.3.4 培养基对芽孢杆菌B006 产生surfactin 量的影响  32-33
    3.3.5 培养时间对芽孢杆菌B006 产生surfactin 量的影响  33
  3.4 讨论  33-35
第四章芽孢杆菌B006 在辣椒根上产生脂肽类抗生素surfactin 的检测  35-39
  4.1 材料  35
    4.1.1 菌株  35
    4.1.2 培养基  35
    4.1.3 药品试剂  35
  4.2 实验方法  35-36
    4.2.1 SPE 柱淋洗条件对抗生素surfactin 提取效果的影响  35-36
    4.2.2 土壤吸附作用对抗生素surfactin 提取的影响  36
    4.2.3 辣椒根上抗生素surfactin 的检测  36
  4.3 结果与分析  36-37
    4.3.1 SPE 柱淋洗条件对抗生素surfactin 提取效果的影响  36-37
    4.3.2 土壤吸附作用对抗生素surfactin 提取的影响  37
    4.3.3 芽孢杆菌B006 在辣椒根上产生抗生素surfactin 的检测  37
  4.4 讨论  37-39
第五章结论与创新性  39-40
  5.1 本论文的主要结论  39
  5.2 创新点  39-40
参考文献  40-46
附录  46-59
在读期间发表论文  59-60
作者简历  60-61
致谢  61-62

辣椒疫霉病生防芽孢杆菌快速筛选及菌株B006的代谢活性物质研究

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