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溶藻弧菌双精氨酸蛋白转运系统和六型分泌系统的研究

作　者: 贺红红
导　师: 张元兴；王启要
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 碱性丝氨酸蛋白酶双精氨酸转运系统六型分泌系统溶藻弧菌
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

为了更好地存活和定植于各种生态环境,细菌在长期的进化过程中演化出多种蛋白运输系统,从而将细菌胞内的特定蛋白质转运到细胞外。作为两种完全不同于传统GSP (General secretion pathway)系统的蛋白运输系统,近年来被发现的双精氨酸转运系统(Twin arginine translocation system, Tat)和六型分泌系统(Type six secretion system, T6SS)和病原菌的环境适应能力以及致病性有密切的关系。溶藻弧菌是我国南方海水养殖业中最常见的病原性细菌之一。目前人们对于溶藻弧菌的致病机制以及致病因子研究得相对比较少,并且发现在通常致病性弧菌中存在的毒力基因tlh、trh、toxR、ctxA和VPI等与该菌的毒力强弱没有直接相关性。本课题组的前期研究发现,溶藻弧菌中的碱性丝氨酸蛋白酶与其毒力机制相关,而且受到溶藻弧菌中群体感应系统的调控作用。为了研究碱性丝氨酸蛋白酶的可能的分泌机制,本课题着眼于该菌中尚未鉴定的Tat系统和T6SS系统,克隆和分析了一个编码完整Tat系统的基因簇和两套完整的T6SS基因簇。在此基础上,构建了溶藻弧菌Tat突变株和T6SS突变株,并系统研究了两套蛋白转运(分泌)系统与溶藻弧菌毒力机制的关系。本研究发现溶藻弧菌致病株EPGS基因组中Tat基因簇与大肠杆菌和霍乱弧菌中已经鉴定的Tat系统高度同源。研究还发现Tat系统与其运动性和生物被膜的形成直接相关。同时,在氧化还原环境下或者渗透压环境下,溶藻弧菌Tat系统突变株对氧应激、温度变异、乙醇、渗透压以及限铁环境更加敏感,表现出生长缺陷表型。另外,TatC突变株的产胞外碱性丝氨酸蛋白酶的能力显著降低,对斑马鱼的毒力也明显减弱,表明Tat系统在溶藻弧菌中不但参与响应各种环境应激,而且与其毒力调控系统密切相关。而T6SS突变株也基本丧失了产生碱性丝氨酸蛋白酶的能力,对斑马鱼的毒力也部分减弱,表明T6SS也参与了碱性丝氨酸蛋白酶的合成调控,并和毒力机制密切相关。这些工作为开发针对溶藻弧菌的特异性疫苗或药物研究开辟了一个新的领域。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章文献综述  10-22
  1.1 海水养殖病原菌  10
  1.2 弧菌病及其致病机理  10-12
    1.2.1 弧菌病  10-11
    1.2.2 弧菌的致病机理  11-12
  1.3 重要的海水养殖病原菌—溶藻弧菌  12-13
  1.4 双精氨酸蛋白转运(Tat)系统和六型分泌系统(T6SS)  13-19
    1.4.1 革兰氏阴性菌分泌系统  13-15
    1.4.2 双精氨酸蛋白转运系统  15-17
      1.4.2.1 双精氨酸蛋白转运系统的组成和功能  15-16
      1.4.2.2 双精氨酸蛋白转运系统底物蛋白  16-17
      1.4.2.3 双精氨酸蛋白转运系统在蛋白质工程中的应用  17
    1.4.3 六型分泌系统  17-19
      1.4.3.1 六型分泌系统的结构和功能  17-19
      1.4.3.2 六型分泌系统介导毒力表型多样性  19
  1.5 本课题的研究背景及意义  19-22
第2章溶藻弧菌Tat蛋白转运系统基因簇的克隆和鉴定  22-28
  2.1 前言  22
  2.2 实验材料  22
    2.2.1 菌株和质粒以及引物  22
    2.2.2 主要分子生物学试剂及试剂盒  22
    2.2.3 培养基  22
  2.3 实验方法  22-24
    2.3.1 溶藻弧菌Tat蛋白转运系统基因簇的克隆及其测序  22-24
    2.3.2 基因序列及登陆号  24
  2.4 结果与讨论  24-27
    2.4.1 溶藻弧菌Tat蛋白转运系统基因簇的克隆  24
    2.4.2 tatABC基因簇的序列分析  24-25
    2.4.3 Tat蛋白转运系统底物蛋白分析  25-27
  2.5 小结  27-28
第3章溶藻弧菌tatABC基因簇突变株和互补株的筛选和鉴定  28-35
  3.1 前言  28
  3.2 实验原理  28
  3.3 实验材料和方法  28-32
    3.3.1 菌株和质粒以及引物  28-29
    3.3.2 溶藻弧菌Tat相关无标记突变株的构建  29-30
    3.3.3 溶藻弧菌互补株的构建  30-32
  3.4 结果与讨论  32-34
    3.4.1 筛选和鉴定基因簇的无标记突变株和互补株  32-33
    3.4.2 tatABC基因簇在TMAO还原酶分泌中的作用  33-34
  3.5 小结  34-35
第4章 tatABC基因簇对运动性和生物被膜生成的影响  35-38
  4.1 前言  35
  4.2 实验材料和方法  35
    4.2.1 群游性(swarming)和游动性(swimming)的测定  35
    4.2.2 生物被膜生成测定  35
  4.3 结果与讨论  35-37
    4.3.1 tatABC基因簇对运动性的影响  35-36
    4.3.2 tatABC基因簇对生物被膜生成的影响  36-37
  4.4 小结  37-38
第5章 tatABC基因簇对生长和环境应激的影响  38-42
  5.1 前言  38
  5.2 实验材料和方法  38
    5.2.1 生长曲线的测定  38
    5.2.2 各种应激对生长影响的测定  38
  5.3 结果与讨论  38-41
    5.3.1 tatABC基因簇对生长的影响  38-39
    5.3.2 tatABC基因簇对响应各种应激的影响  39-41
  5.4 小结  41-42
第6章溶藻弧菌tatABC基因簇对胞外蛋白酶合成和毒力的影响  42-46
  6.1 前言  42
  6.2 实验方法  42-43
    6.2.1 抗体的制备  42
    6.2.2 蛋白印迹  42-43
    6.2.3 碱性丝氨酸蛋白酶的检测  43
    6.2.4 斑马鱼毒力试验  43
  6.3 结果与讨论  43-45
    6.3.1 tatABC基因簇对碱性丝氨酸蛋白酶合成的影响  43-44
    6.3.2 tatABC基因簇对斑马鱼毒性影响  44-45
  6.4 小结  45-46
第7章溶藻弧菌六型分泌系统(T6SS)基因簇的克隆和鉴定  46-52
  7.1 前言  46
  7.2 实验材料  46
  7.3 实验方法  46
    7.3.1 溶藻弧菌T6SS系统基因簇的克隆及其测序  46
    7.3.2 基因序列及登陆号  46
  7.4 结果与讨论  46-51
    7.4.1 溶藻弧菌T6SS系统基因簇的克隆  46-47
    7.4.2 基因簇的序列分析  47-51
  7.5 小结  51-52
第8章溶藻弧菌T6SS基因簇突变株的筛选和鉴定  52-58
  8.1 前言  52
  8.2 实验材料和方法  52-53
  8.3 结果与讨论  53-57
    8.3.1 筛选和鉴定T6SS基因簇的无标记突变株  53-55
    8.3.2 T6SS对溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶合成的影响  55-56
    8.3.3 T6SS对溶藻弧菌毒性的影响  56-57
  8.4 小结  57-58
第9章结论与展望  58-60
  9.1 结论  58
  9.2 展望  58-60
参考文献  60-65
论文发表  65-66
致谢  66

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