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东亚飞蝗一氧化氮合酶基因的克隆与功能研究

作　者: 夏新
导　师: 夏玉先
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 东亚飞蝗一氧化氮合酶绿僵菌半定量RT-PCR
分类号: S433.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

一氧化氮合酶在生物体内专一催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸和一氧化氮。NO作为一种信号分子,具有调节内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞等功能;作为一种效应分子,参与组织损伤修复,在呼吸、消化、循环免疫等全身多系统的生理、病理生理及有关临床疾病中起着重要作用。一氧化氮合酶催化NO合成过程中,以L-精氨酸和O2为底物,还需要多种辅助因子与调控因子,包括NADPH、四氢生物喋呤、FAD和FMN、钙调蛋白与Fe-PPIX。虽然有关昆虫一氧化氮合酶基因的研究已经比较多,大量编码一氧化氮合酶的cDNA序列也已被克隆,但是东亚飞蝗作为一种世界性的农业害虫,目前尚无相关研究报道。本研究以东亚飞蝗为研究对象,采用RT-PCR和RACE方法克隆东亚飞蝗一氧化氮合酶的基因序列,并分析了该基因在不同组织的表达特征。为研究昆虫内源性NO在对付细菌、病毒、肿瘤细胞等病原体方面如何发挥着至关重要的作用,以绿僵菌CQMa102菌株自然接种侵染羽化3天的群居型东亚飞蝗雄虫为研究材料,分析了不同组织、不同侵染时期一氧化氮合酶基因的表达谱,为东亚飞蝗免疫系统的分子水平研究以及昆虫与病原微生物相互作用机理研究奠定基础。从东亚飞蝗的脂肪体中得到长度为3508bp的cDNA序列。其5’端非翻译区297bp,3’端非翻译区有202bp,编码区为3006bp,共编码1002个氨基酸。通过半定量RT-PCR方法检测一氧化氮合酶的组织表达特征发现:LmNOS在东亚飞蝗的头、腿、脂肪体、中肠和血细胞中均有表达,并且在脂肪体、头中呈现高表达趋势,其次是血细胞,而在腿及中肠中表达较弱。由东亚飞蝗一氧化氮合酶基因的组织定位可见,一氧化氮合酶基因在昆虫中多个组织不同时间段中发挥作用,作用范围广,作用周期长,因而可以初步推断一氧化氮合酶在昆虫的生长、发育、代谢等过程中发挥着重要的作用。同时,哺乳动物中有研究表明一氧化氮合酶在小鼠的生理过程中扮演着信号分子和效应分子的角色,发生作用的组织一般为代谢、抗病及细胞行为所发生相关组织,与本研究结果吻合;由此我们可以初步推断,在东亚飞蝗中,一氧化氮合酶扮演着与哺乳动物类似的角色。以绿僵菌CQMa102菌株自然接种侵染羽化3天的群居型东亚飞蝗雄虫,研究侵染后不同时期、不同组织LmNOS的表达特征,推断36h至48h可能是昆虫运用其自身先天免疫对抗病原微生物的重要时期。

全文目录

中文摘要  3-4
英文摘要  4-8
1 绪论  8-21
  1.1 引言  8-9
  1.2 研究背景及研究进展  9-15
    1.2.1 一氧化氮  9-10
    1.2.2 NO 的合成与代谢  10-11
    1.2.3 NO 的生物学机制  11
    1.2.4 NO 生物学功能  11-15
  1.3 一氧化氮合酶  15-18
    1.3.1 NOS 酶学特性  15-16
    1.3.2 辅助因子（Cofactors）和辅基（Prosthetic Groups）  16-17
    1.3.3 NOS 的定位  17-18
    1.3.4 NOS 活性调节及抑制剂  18
  1.4 研究目的  18-19
  1.5 研究内容及技术路线  19
    1.5.1 研究内容  19
    1.5.2 技术路线  19
  1.6 本研究创新之处  19-21
2 材料与方法  21-37
  2.1 材料  21-22
    2.1.1 供试昆虫  21
    2.1.2 菌株与载体  21
    2.1.3 仪器设备  21
    2.1.4 主要试剂  21-22
    2.1.5 主要溶液配制  22
  2.2 东亚飞蝗一氧化氮合酶(LmNOS)基因的克隆及序列分析  22-36
    2.2.1 LmNOS 基因片段克隆  23-28
    2.2.2 3’RACE 克隆LmNOS 基因的3’端序列  28-31
    2.2.3 5’RACE 克隆LmNOS 基因的5’端序列  31-33
    2.2.4 LmNOS 基因的序列分析  33-34
    2.2.5 半定量RT-PCR 检测LmNOS 基因的表达  34-36
  2.3 绿僵菌侵染不同时期，LmNOS 基因在各组织中的表达情况  36-37
3 结果与分析  37-49
  3.1 东亚飞蝗一氧化氮合酶(LmNOS)基因的克隆及序列分析  37-46
    3.1.1 LmNOS 基因片段克隆  37-40
    3.1.2 3’RACE 克隆LmNOS 基因的3’端cDNA 序列  40-41
    3.1.3 5’RACE 克隆LmNOS 基因的5’端cDNA 序列  41-44
    3.1.4 东亚飞蝗扩增NOS cDNA 序列拼接结果及分析  44-46
  3.2 东亚飞蝗一氧化氮合酶(LmNOS)基因的组织表达分析  46-47
  3.3 绿僵菌侵染不同时期，LmNOS 基因在各组织中的表达情况  47-49
4 讨论  49-51
  4.1 东亚飞蝗一氧化氮合酶基因克隆及组织定位  49
  4.2 绿僵菌侵染不同时期，LmNOS 基因在各组织中的表达情况  49-50
  4.3 小结  50-51
5 结论及后续工作  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-57
附录  57-58
附件  58-65

东亚飞蝗一氧化氮合酶基因的克隆与功能研究

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