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吡虫啉残留免疫学快速检测技术研究

作　者: 李广领
导　师: 陈锡岭；王自良
学　校: 河南科技学院
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 吡虫啉 人工半抗原 完全抗原 ELISA 抗体 残留快速检测试剂盒
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


采用HPLC-MS、IR、UV和NMR技术,对通过化学修饰合成的吡虫啉（IMI）人工半抗原及EDC法合成的IMI完全抗原进行了结构表征,证明IMI人工半抗原和完全抗原合成成功,且完全抗原中半抗原与载体蛋白的偶连比为18.5∶1。应用合成的IMI完全抗原按一定的免疫程序免疫实验小鼠,对其免疫抗血清的免疫学特性进行了鉴定。间接ELISA效价实验结果表明:所免疫5只实验小鼠均产生了较高效价的免疫抗血清（IMI-pAb）,其中5号免疫鼠的IMI-pAb效价最高,达1∶1.28×104;其次是2号免疫鼠,为1∶6.4×103。方阵滴定法确定了最佳抗原包板浓度为2μg/mL,2号免疫鼠和5号免疫鼠IMI-pAb的最佳稀释倍数分别为1∶3.2×103倍和1∶6.4×103倍。在此基础上,结合厂家推荐酶标二抗（RaMIgG-HRP）工作浓度进行了抗原和抗体的阻断ELISA实验,得2号和5号免疫鼠IMI-pAb对IMI的IC50分别为9.0×10-5 mg/mL和1.0×10-4 mg/mL;以2号免疫鼠血清样本为研究对象进行的IMI与其结构类似物噻虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、噻虫胺的交叉反应性实验,得交叉反应率分别为9.09%、1.00%、0.94%和0.37%。为了获得高效价、强特异性、高亲和力和高检测灵敏度的抗IMI抗体,以选定的2号免疫鼠作为细胞融合制备抗IMI单克隆抗体（IMI-mAb）的备用鼠,经超强免疫后,采用改进的PEG介导细胞融合技术进行了免疫鼠脾细胞和骨髓瘤细胞（NS0）的融合,融合后14 d观察到的细胞杂交成功率为51.6%,阳性率为45.9%。经过3次有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆和筛选,获得了3C8和3E2两个IMI-mAb细胞株,经相关免疫学实验鉴定,得这两个杂交瘤细胞株具有:（1）高效价,3C8和3E2细胞株腹水效价分别为1∶6.4×105,和1∶3.2×105;（2）低检测限,3C8和3E2杂交瘤细胞株对IMI的IC20分别为7.48×10-6 mg/mL和9.47×10-6 mg/mL;（3）高检测灵敏度,3C8和3E2杂交瘤细胞株对IMI的IC50分别为4.92×10-5 mg/mL和5.45×10-5 mg/mL;（3）强特异性,所测试4种IMI结构类似物中,3C8和3E2细胞株只与噻虫啉有弱交叉反应;（4）强亲和力,3C8和3E2细胞株对抗原的亲和常数分别为1.10×1012 L/moL和2.36×1011 L/moL。通过实验建立的基于IMI-mAb的IMI残留阻断ELISA ,在8.30×10-6 mg/mL5.32×10-4 mg/mL的IMI浓度范围内与对应的抑制率线性关系良好,方法的最低检测限为8.00×10-6 mg/mL;采用简易样本前处理程序,两种模拟残留样本中IMI各添加水平的回收率均大于75.0%（CV<10.0%）;IMI-mAb与IMI四个结构类似物的交叉反应实验表明,除噻虫啉外,与其余三种化合物均无交叉反应。IMI残留阻断ELISA与GC-FID检测方法的比较结果说明,二者的线性范围和检测限相当。另外,对于GC-FID方法而言,简易残留样本前处理程序带来的严重基质干扰和较低的添加回收率无法满足实际的定量检测工作需要。根据所建立阻断ELISA装配的IMI残留检测试剂盒的质量稳定性试验表明,在4℃下其质量保证期在5个月以上。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章 吡虫啉残留检测研究进展  13-23
  1.1 吡虫啉的研究开发情况  13
  1.2 吡虫啉的理化特性  13-14
  1.3 吡虫啉的毒理学特性  14
  1.4 吡虫啉对环境生物的影响  14-16
    1.4.1 对蜜蜂和家蚕的影响  14-15
    1.4.2 对水生生物的影响  15
    1.4.3 对土壤有益生物的影响  15
    1.4.4 对天敌生物的影响  15-16
    1.4.5 对农作物的影响  16
  1.5 吡虫啉对动物和人类的影响  16-17
  1.6 吡虫啉的构效关系  17-18
  1.7 吡虫啉对害虫的防治作用  18-19
    1.7.1 吡虫啉对害虫的防效  18
    1.7.2 害虫对吡虫啉的抗性  18-19
  1.8 吡虫啉的残留分析方法  19-20
    1.8.1 吡虫啉的残留限量标准  19
    1.8.2 IMI 的残留检测方法  19-20
  1.9 本研究的目的与意义  20-21
  1.10 本研究的主要内容和技术路线  21-23
    1.10.1 主要研究内容  21-22
    1.10.2 技术路线  22-23
第二章 吡虫啉人工抗原的合成与结构鉴定  23-35
  2.1 材料与方法  23-27
    2.1.1 药品与试剂  23
    2.1.2 溶液  23-24
    2.1.3 实验仪器  24
    2.1.4 实验方法  24-27
  2.2 结果与分析  27-31
    2.2.1 IMI人工半抗原的结构鉴定  27-31
    2.2.2 IMI完全抗原中载体蛋白含量  31
  2.3 小结与讨论  31-35
    2.3.1 IMI半抗原的设计与合成  31-32
    2.3.2 IMI完全抗原的合成  32-35
第三章 吡虫啉多克隆抗体的制备及其免疫学特性研究  35-45
  3.1 材料与方法  35-38
    3.1.1 药品与试剂  35
    3.1.2 溶液  35-36
    3.1.3 实验仪器  36
    3.1.4 实验动物  36
    3.1.5 实验方法  36-38
  3.2 结果与分析  38-43
    3.2.1 吡虫啉多克隆抗体的效价  38-39
    3.2.2 吡虫啉多克隆抗体对吡虫啉的检测灵敏度和特异性  39-43
  3.3 小结与讨论  43-45
    3.3.1 实验小鼠的选择和免疫方式  43-44
    3.3.2 吡虫啉人工抗原的免疫原性  44-45
第四章 吡虫啉单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定  45-61
  4.1 材料与方法  47-52
    4.1.1 材料  47-49
    4.1.2 细胞融合与阳性杂交瘤细胞株的筛选  49-51
    4.1.3 IMI-mAb 免疫学特性鉴定  51-52
  4.2 结果与分析  52-57
    4.2.1 细胞融合效果  52
    4.2.2 杂交瘤核型鉴定  52-53
    4.2.3 同种型及亚类鉴定  53
    4.2.4 效价测定  53-54
    4.2.5 检测灵敏度  54-55
    4.2.6 亲和力测定  55-56
    4.2.7 特异性测定  56-57
  4.3 小结与讨论  57-61
    4.3.1 免疫小鼠的超强免疫方法  57
    4.3.2 细胞融合程序  57-58
    4.3.3 杂交瘤细胞株的筛选  58
    4.3.4 IMI-mAb 的免疫学特性鉴定  58-59
    4.3.5 IMI-pAb 和 IMI-mAb 的比较  59-61
第五章 吡虫啉残留ELISA 快速检测试剂盒的研制及性能测定  61-73
  5.1 材料与方法  61-64
    5.1.1 药品与试剂  61
    5.1.2 实验材料  61
    5.1.3 实验仪器  61-62
    5.1.4 实验方法  62-64
  5.2 结果与分析  64-70
    5.2.1 最佳抗体稀释倍数和包被抗原工作浓度  64
    5.2.2 阻断ELISA 方法的建立  64-68
    5.2.3 阻断ELISA 试剂盒的装配及性能测定  68-70
  5.3 讨论  70-73
    5.3.1 农药残留ELISA 检测技术的地位  70
    5.3.2 小分子半抗原的ELISA 检测模式  70-71
    5.3.3 所建立ELISA 检测方法的评价  71-73
研究结论  73-75
参考文献  75-86
附录  86-87
致谢  87-89
攻读学位期间取得的研究成果  89-90

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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