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4种肿瘤标志物的体外表达及Survivin自身抗体在NSCLC患者中的临床意义

作　者: 马丽
导　师: 岳文涛
学　校: 北京市结核病胸部肿瘤研究所
专　业: 免疫学
关键词: 原核表达融合蛋白 Survivin自身抗体 NSCLC 间接ELISA 联合检测
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的:在世界范围内,恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的主要原因,肺癌发生率和死亡率居于恶性肿瘤的首位。肺癌早期诊断成为科学界严峻性的挑战。目前应用于肺癌临床检查方法很多,肿瘤标志物在肺癌早期诊断所具有的优势以及肿瘤标志物对高危人群筛查所具有的潜在应用价值,吸引了大量学者的关注。随着分子生物学和人类基因组计划的进展,越来越多的特异性肿瘤标志物被发现,肿瘤相关自身抗体作为其中的一种,在多种癌症中均有不同程度研究。理想状态的肿瘤标志物至今还未发现,单一肿瘤标志物对癌症检测的敏感性及特异性不高,肿瘤标志的联合检测成为一种研究趋势。故本实验的目的是实现Survivin、EGFR胞外段、CyclinB1、CCNY四种融合蛋白的体外表达,为建立NSCLC患者血清中自身抗体检测的ELISA方法,探讨4种肿瘤标志物自身抗体联合检测的临床意义及应用打下坚实的基础。方法:采用RT-PCR方法获得Survivin、EGFR胞外段、CyclinB1、CCNY的cDNA,构建原核表达载体pET30a( +)/survivin、pET30a( +)/egfr、pET30a(+)/cyclinb1、pET30a( +)/ccny。IPTG诱导四种质粒在E.coil BL21 (DE3)中的表达,确定融合蛋白的表达部位,利用亲和层析方法纯化蛋白,12%SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。并建立基于Survivin融合蛋白的间接ELISA方法,对89例健康志愿者、215例NSCLC患者以及20例肺部良性疾病患者的血清样本进行检测。结果:经酶切、测序验证了4种原核表达载体的成功构建;在最适IPTG浓度及最适诱导时间下,顺利诱导出4种融合蛋白, SDS-PAGE电泳以及Westernblot验证;4种融合蛋白在E.coil BL21(DE3)中均以包涵体的形式表达,尤其是Survivin蛋白在E.coil BL21(DE3)中高效表达,其蛋白表达量约占菌体总蛋白的50%;采用镍离子亲和层析的方法纯化4种融合蛋白,所得4种蛋白纯度均在80%以上,尤其是Survivin蛋白,其纯度可达90%以上;建立检测Survivin自身抗体的间接ELISA方法,检测结果显示Survivin自身抗体在NSCLC患者血清中的含量与健康志愿者相比较,具有统计学意义上的差异,P< 0.05。Survivin自身抗体检测的敏感性为19.5%、特异性为88.9%。Survivin自身抗体与NSCLC患者的肿瘤的大小以及远处转移存在统计学意义上的相关性,P<0.05。Survivin自身抗体与CEA在NSCLC患者中联合检测的阳性率明显高于CEA与NSE、SCC、CYFRA、ProGRP联合检测的阳性率,大大提高NSCLC检出的敏感性。结论:本实验成功构建pET30a( +)/survivin、pET30a( +)/egfr、pET30a(+)/cyclinb1、pET30a( +)/ccny 4种原核表达载体;顺利纯化出四种融合蛋白;并建立检测Survivin自身抗体的间接ELISA方法,Survivin自身抗体与肺癌肿瘤大小、远处转移所具有的相关性及在联合检测中的重要作用,为Survivin自身抗体在肺癌的临床应用提供了线索和依据。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
论文  9-60
  前言  9-12
  研究对象  12-14
  实验材料和试剂  14-19
  实验方法  19-27
  结果判定和数据处理  27-28
  实验结果  28-52
  讨论  52-56
  参考文献  56-60
英文缩写注释  60-61
综述  61-69
  正文  61-67
  参考文献  67-69
致谢词  69

4种肿瘤标志物的体外表达及Survivin自身抗体在NSCLC患者中的临床意义

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