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谷氨酰胺合成酶产酶菌株的筛选

作 者: 刘川顺
导 师: 李平
学 校: 安徽农业大学
专 业: 食品科学
关键词: 谷氨酰胺合成酶 米曲霉 紫外诱变 发酵条件 酶学性质
分类号: TQ925
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 83次
引 用: 1次
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内容摘要


谷氨酰胺合成酶(GS,glutamine synthetase;EC6.3.1.2)是生物体内广泛存在的酶,它参与许多生物体的氮和碳代谢。而氮代谢是生物体维持生命所必需的,因此,它是生物体内最为关键的酶类之一。谷氨酰胺合成酶在生物体内的分布及生理功能的研究也很透彻。此外,它也是体外微生物酶促转化合成茶氨酸的重要酶类之一,更是谷氨酰胺工业化生产中极其重要的催化剂,是非常有价值的物质,故对其需求量也日益增多。利用微生物发酵生产谷氨酰胺合成酶是条经济而又高效的途径。目前谷氨酰胺合成酶的产酶菌株主要是节杆菌属的一些细菌。而利用霉菌发酵生产谷氨酰胺合成酶的研究却很少,米曲霉更是没被研究过。本实验首先从实验室保藏的菌株中筛选出具有较高产酶能力的米曲霉,并对其进行紫外诱变、优化发酵条件酶学性质的研究。实验中首先从实验室保藏的菌株中筛选出具有较高产谷氨酰胺合成酶能力的米曲霉。进而对米曲霉进行紫外诱变,诱变条件为:紫外灯15W,照射距离20cm,照射时间120S。最后,经过、复筛和遗传稳定性实验,选育出的诱变菌株产谷氨酰胺合成酶的能力比出发菌株提高了15.6%。其次,对选育出的米曲霉进行发酵条件的优化,先进行单因子实验,筛选出米曲霉液态发酵产谷氨酰胺合成酶的最适碳源、氮源、起始pH、装液量、发酵温度、摇床转速和诱导因子。结果表明最适碳源为蔗糖,最适氮源为蛋白胨,最适起始pH为6,最适装液量为60ml,最适发酵培养温度为28℃,最适摇床转速为160r/min,最适诱导因子为谷氨酸钠。再通过正交实验确定四种显著影响因子的添加量,优化培养基的成分和液体发酵条件,使选育出的米曲霉产谷氨酰胺合成酶的能力进一步提高。再次,对超声波破碎器破碎米曲霉细胞壁的条件进行研究,分别设定不同的工作时间和间隔时间,再对总时间进行优化,结果表明在超声波破碎器功率为400W的条件下,工作1S,间隔3S,20min,是破碎米曲霉细胞壁的最适破碎条件。最后,对提取的谷氨酰胺合成酶的粗酶液进一步的纯化,通过实验对米曲霉谷氨酰胺合成酶的酶学性质进行初步的研究。结果表明最适酶促反应时间为:30min,最适pH为为6.5,最适温度为60℃,并且得出Mg2+、Mn2+对维持酶活至关重要。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
1 文献综述  9-18
  1.1 谷氨酰胺合成酶的简述  9-14
    1.1.1 谷氨酰胺合成酶的结构  9-10
    1.1.2 谷氨酰胺合成酶的分布  10
    1.1.3 谷氨酰胺合成酶的生理功能  10-11
    1.1.4 谷氨酰胺合成酶的研究进展  11-12
    1.1.5 酶法合成茶氨酸  12-13
    1.1.6 谷氨酰胺合成酶催化合成酸  13-14
  1.2 菌株简述  14-15
    1.2.1 枯草杆菌  14
    1.2.2 大肠杆菌  14
    1.2.3 米曲霉  14-15
  1.3 米曲霉紫外诱变  15-18
2. 引言  18-20
  2.1 课题的立题背景及意义  18-19
  2.2 本论文的主要研究内容  19
  2.3 课题来源  19-20
3. 材料与方法  20-29
  3.1 材料  20
    3.1.1 菌株  20
    3.1.2 培养基  20
      3.1.2.1 真菌培养基  20
      3.1.2.2 细菌培养基  20
  3.2 主要试剂  20-21
  3.3 主要仪器  21
  3.4 酶活力测定  21-23
    3.4.1 酶活力定义  21-22
    3.4.2 酶活力的测定方法  22
    3.4.3 蛋白质的测定  22-23
  3.5 菌株的发酵培养条件  23
  3.6 菌株的收集  23
  3.7 菌株的超声波破碎  23
  3.8 粗酶液的制备  23-24
  3.9 菌株的筛选  24
  3.10 菌体生长曲线的测定  24
  3.11 菌体的紫外诱变  24-25
    3.11.1 孢子悬浮液的制备  24
    3.11.2 诱变时间的测定  24-25
    3.11.3 初筛  25
    3.11.4 复筛  25
    3.11.5 遗传稳定性的测定  25
  3.12 突变高产谷氨酰胺合成酶菌株发酵条件的优化  25-27
    3.12.1 碳源优化筛选  25
    3.12.2 氮源优化筛选  25
    3.12.3 起始pH 优化筛选  25-26
    3.12.4 发酵温度优化筛选  26
    3.12.5 摇床转速优化筛选  26
    3.12.6 装液量优化筛选  26
    3.12.7 诱导因子优化筛选  26
    3.12.8 正交实验  26-27
  3.13 超声波破碎条件的优化  27
  3.14 谷氨酰胺合成酶的初步纯化  27-28
    3.14.1 粗酶液的制备  27
    3.14.2 硫酸铵分级沉淀  27-28
    3.14.3 透析除盐  28
  3.15 谷氨酰胺合成酶的酶学性质  28-29
    3.15.1 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适作用时间  28
    3.15.2 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适pH  28
    3.15.3 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适温度  28
    3.15.4 金属离子对谷氨酰胺合成酶酶促反应的影响  28-29
4. 结果与分析  29-46
  4.1 蛋白质标准曲线的绘制  29
  4.2 菌株筛选的结果  29-30
  4.3 米曲霉生长曲线  30
  4.4 米曲霉紫外诱变  30-32
    4.4.1 诱变时间测定的结果  30-31
    4.4.2 初筛的结果  31
    4.4.3 复筛的结果  31
    4.4.4 遗传稳定性实验  31-32
  4.5 发酵条件优化的结果  32-38
    4.5.1 碳源优化的结果  32-33
    4.5.2 氮源优化的结果  33
    4.5.3 起始pH 优化的结果  33-34
    4.5.4 发酵温度优化的结果  34-35
    4.5.5 摇床转速优化的结果  35
    4.5.6 装液量优化的结果  35-36
    4.5.7 诱导因子优化的结果  36-37
    4.5.8 正交实验的结果  37-38
  4.6 超声波破碎条件优化的结果  38-42
  4.7 谷氨酰胺合成酶初步纯化的结果  42
  4.8 谷氨酰胺合成酶酶学性质  42-46
    4.8.1 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适作用时间优化的结果  42-43
    4.8.2 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适pH 优化的结果  43
    4.8.3 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适温度优化的结果  43-44
    4.8.4 金属离子对谷氨酰胺合成酶酶促反应影响的结果  44-46
5. 主要结论  46-47
参考文献  47-51
致谢  51-52
作者简介  52
攻读硕士学位期间发表的论文  52

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂(酵素)
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