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转TrxS基因啤酒大麦种子蛋白质组学分析

作　者: 景晓东
导　师: 尹钧
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 啤酒大麦 TrxS基因贮藏蛋白 SDS-PAGE 2-DE
分类号: S512.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

啤酒大麦籽粒蛋白质含量的高低及其在制麦过程中代谢速率的快慢是决定其酿造品质优劣的关键。本文首先以转外源TrxS基因啤酒大麦株系Franklin及Harrington(分别以F、H表示)的种子为试验材料,利用分步提取法分析转基因及对照株系在籽粒萌发前后胚乳贮藏蛋白组分的含量变化,以及利用SDS-PAGE技术寻找差异表达蛋白,试图从蛋白组学角度探索导入外源TrxS基因对啤酒大麦种子萌发速率的影响及对其品质改良方面的可行性；其次,以2个转TrxS基因啤酒大麦矮化株系H-7-5-14-2和H-7-5-14-5为试验材料,以转基因正常株系及非转基因H-CK为对照,在对其花后15d成熟植株株高农艺表型进行统计分析的基础上,采用传统TCA-Ac法提取转基因矮化株系H-7-5-14-2的种子及幼苗(三叶期)叶片总蛋白(以H-CK为对照),通过双向凝胶电泳技术对其表达谱分别做了初步研究。主要研究结果如下：1.对成熟期及萌发期种子贮藏蛋白的含量测定结果表明,转TrxS基因株系种子胚乳内总蛋白及贮藏蛋白组分的含量与非转基因对照间无显著差异；萌发2d时,转基因株系胚乳中总蛋白迅速分解、含量下降,球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量变化趋势与总蛋白类似,含量迅速下降(个别株系有例外),清蛋白含量上升,并与对照间达极显著水平。2.供试株系籽粒萌发前后胚乳内贮藏蛋白组分SDS-PAGE图谱显示：(1)清蛋白图谱中,籽粒萌发2d时,高分子量条带数减少,相应低分子量约10-16 kD处的蛋白条带数目增加；(2)球蛋白图谱中,F株系籽粒未萌发时,在66.2-94.0 kD和35.0-45.0 kD之间各有一条表达量明显不同的蛋白条带；H-CK籽粒萌发2d时,在靠近66.2 kD下方及45.0 kD上方各有一蛋白条带发生降解,在其相应各转基因株系中未能看到这一变化；(3)醇溶蛋白图谱中,F、H-CK与其各自转基因株系相比,在35.0-45.0 kD之间均出现一条特异表达的蛋白条带,籽粒萌发2d时,该条带未见降解；(4)谷蛋白图谱中,籽粒萌发前后,各株系均未见有明显差异表达的条带,且各泳道所分离出来的蛋白条带数目有限。3.田间统计分析结果显示,2个矮化株系的株高与对照相比,分别降低了17.25cm和16.63cm,且都达到极显著水平。此外,矮化株系H-7-5-14-2及其非转基因对照H-CK的种子及三叶期叶片总蛋白2-DE图谱显示,二者之间存在一些差异表达蛋白点,而且个别蛋白点的表达呈现出极显著差异。

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致谢 4-9摘要 9-101 文献综述 10-22 1.1 啤酒大麦的生产及其酿造品质 10-13 1.1.1 我国啤酒大麦供需现状 10-11 1.1.2 我国现有啤酒大麦品种在品质上存在的主要问题 11-13 1.2 硫氧还蛋白的研究进展 13-16 1.2.1 Trx的种类及其亚细胞定位 13-14 1.2.2 Trx的结构与其氧化还原催化机制 14-15 1.2.3 Trx靶蛋白的研究 15 1.2.4 Trx的生物学功能 15-16 1.2.5 本实验室对Trx的研究 16 1.3 蛋白质组学研究进展 16-22 1.3.1 蛋白质组学概念及其研究内容 17 1.3.2 蛋白质组学研究的技术手段 17-21 1.3.2.1 SDS-PAGE技术在蛋白质组学研究中的应用及其局限 17-18 1.3.2.2 向电泳技术的发展及其所面临的挑战 18-20 1.3.2.3 生物质谱技术 20-21 1.3.3 蛋白质组学研究展望 21-222 引言 22-24 2.1 本文研究背景 22 2.2 研究目的与意义 22 2.3 技术路线 22-243 材料与方法 24-32 3.1 试验材料 24-27 3.1.1 材料来源 24 3.1.2 仪器设备及试剂来源 24 3.1.3 试剂配制 24-27 3.2 试验方法 27-32 3.2.1 蛋白标准曲线的制作 27 3.2.2 转基因株系胚乳蛋白含量变化及其SDS-PAGE图谱分析 27-29 3.2.2.1 材料处理 28 3.2.2.2 未萌发大麦籽粒胚乳内可溶性总蛋白的提取 28 3.2.2.3 大麦籽粒萌发期胚乳内蛋白组分的分步提取 28 3.2.2.4 蛋白提取液定量 28 3.2.2.5 蛋白提取液浓缩 28 3.2.2.6 SDS-PAGE不连续系统凝胶的制备 28-29 3.2.2.7 蛋白样品的处理、上样及电泳 29 3.2.2.8 凝胶的固定、染色及脱色 29 3.2.3 转基因矮化突变株系株高表型分析及其蛋白组学研究 29-32 3.2.3.1 矮化突变株系株高的测定 29 3.2.3.2 材料处理 29-30 3.2.3.3 TCA-Ac法提取种子及叶片内总蛋白质 30 3.2.3.4 蛋白样品的处理及水化上样 30 3.2.3.5 等电聚焦(IEF) 30 3.2.3.6 胶条的平衡 30 3.2.3.7 第二向(SDS-PAGE)电泳 30 3.2.3.8 凝胶的固定、染色、脱色及后续分析 30-324 结果与分析 32-44 4.1 转基因H株系胚乳蛋白SDS-PAGE分析 32 4.2 转基因株系胚乳蛋白含量变化 32-37 4.2.1 蛋白标准曲线 32-33 4.2.2 F株系胚乳蛋白含量变化 33-35 4.2.3 H株系胚乳蛋白含量变化 35-37 4.3 转基因株系胚乳蛋白SDS-PAGE图谱分析 37-41 4.3.1 F株系胚乳蛋白SDS-PAGE图谱分析 37-39 4.3.2 H株系胚乳蛋白SDS-PAGE图谱分析 39-41 4.4 转基因矮化突变株系株高表型分析及其蛋白组学研究 41-44 4.4.1 矮化突变株系株高表型及其统计分析 41 4.4.2 矮化突变株系籽粒及幼苗叶片总蛋白2-DE图谱分析 41-445 讨论与结论 44-48 5.1 讨论 44-47 5.1.1 蛋白质定量在蛋白质组学研究中的重要性 44 5.1.2 转基因株系胚乳蛋白含量变化及其SDS-PAGE图谱分析 44-46 5.1.2.1 大麦发芽温度选择的依据 44 5.1.2.2 有关试验结果所得图表的说明 44-45 5.1.2.3 导入的外源TrxS基因可能在部分供试材料中发生了共抑制现象 45-46 5.1.2.4 关于SDS-PAGE技术的几点优化 46 5.1.3 转基因矮化突变株系选材方面的考虑 46-47 5.2 结论 47-48参考文献 48-55英文摘要 55-56

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