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蛋白激酶Cβ_2在不同血糖模式致人内皮细胞损伤中的作用

作　者: 林雪波
导　师: 周波
学　校: 重庆医科大学
专　业: 内科学
关键词: 蛋白激酶Cβ2 过氧化物酶体增殖物激活受体α 人脐静脉内皮细胞高糖糖尿病视网膜病变活性氧血糖高糖记忆血糖波动二甲双胍
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的研究蛋白激酶C(PKC)β2、PPARα在高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互关系。方法将培养的HUVECs分为以下8组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)组、渗透压对照组(L,NG + 20 mmol/L L-葡萄糖)组、正常糖空载体转染(NN,NG + Ad5-null)组、高糖PKCβ2转染(HB,HG+Ad5-PKCβ2)组、高糖+非诺贝特组(HF,HG + 40μmol/L非诺贝特)组、高糖PKCβ2转染+非诺贝特(HBF,HB + 40μmol/L非诺贝特)组,以上各组细胞均培养6天。另高糖孵育细胞6天后再与非诺贝特共培养20min作为HF20组。以RT-PCR检测VEGF、VCAM-1 mRNA的表达水平,用Western印迹法测定PPARα蛋白表达,采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。结果(1)HG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.91倍和1.56倍(P值均<0.05);HG诱导PKCβ2核转位激活,定量分析示HG组胞浆/胞核荧光强度比值较NG组降低37%(P<0.05);HB组PKCβ2核转位与HG组相比更加明显,VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦进一步增加,分别为NG组的2.59倍和2.07倍(P值均<0.05)。(2)HG组PPARα蛋白表达较NG组减少了20%(P <0.05);与HG组相比,HF组PPARα蛋白水平上调了13%,VEGF、VCAM-1 mRNA表达则明显下调,分别为HG组的68%和74%(P值均<0.05);与HG组相比,HF20组VEGF、VCAM-1 mRNA表达差异无统计学意义。(3)HB组PPARα蛋白水平进一步下降,为HG组的78%(P <0.05)。结论高糖通过诱导HUVECs PKCβ2核转位激活,进而调控PPARα表达,增加VEGF、VCAM-1 mRNA的表达。第二部分蛋白激酶Cβ2-活性氧交互环介导高糖致人内皮细胞损伤记忆效应目的以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为体外模拟高血糖记忆的研究对象,观察蛋白激酶C(PKC)β2、活性氧(ROS)对其表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA的影响,并探讨PKCβ2、ROS在其中可能的交互作用。方法将培养的HUVECs分为以下5组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖×3周)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖×3周)组、记忆(M,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周)组、记忆PKCβ2转染(MB,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周+ Ad5-PKCβ2)组、记忆+α-硫辛酸(MA,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周+62.5μmol/Lα-硫辛酸)组。以RT-PCR法检测VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,用荧光显微镜和荧光酶标仪测定ROS水平,采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。结果(1)HG组和M组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.76倍、1.35倍和1.69倍、1.43倍(P值均<0.05)。(2)HG组和M组ROS水平分别较NG组升高了86%、80% (P值均<0.05);MA组ROS水平较M组下降了38%,同时MA组VEGF、VCAM-1mRNA表达亦较M组显著下调,分别为M组的67%、78%(P值均<0.05)。(3)HG组和M组PKCβ2核转位激活,定量分析显示,胞浆/胞核荧光强度比值均较NG组下降,分别为NG组的70%、74%( P值均<0.05);MB组PKCβ2核转位较M组更为明显,胞浆/胞核荧光强度比值为M组的77%,同时MB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦较M组进一步上调,分别为M组的1.29倍、1.18倍(P值均<0.05)。(4)MA组PKCβ2核转位较M组减少,胞浆/胞核荧光强度比值为M组的1.18倍;而MB组ROS水平较M组上调了25%(P值均<0.05)。结论HUVECs存在高糖记忆效应,PKCβ2-ROS交互环可能介导了这个效应的发生。第三部分高糖波动激活蛋白激酶Cβ2损伤人内皮细胞及二甲双胍的干预作用目的观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA表达及活性氧(ROS)水平的不同影响,探讨PKCβ2在其中的作用及二甲双胍(Metformin)的干预影响。方法将培养的HUVECs分为以下5组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、持续性高糖(SHG,15 mmol/L D-葡萄糖)组、波动性高糖(IHG,5 mmol/L D-葡萄糖与25mmol/L D-葡萄糖每24h更换一次)组、波动性高糖PKCβ2转染(IHGB,IHG + Ad5-PKCβ2)组、波动性高糖+二甲双胍(IHGM,IHG+20μmol/L二甲双胍)组。以上各组细胞均培养14天。以RT-PCR法检测细胞VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,用荧光酶标仪测定细胞ROS水平,采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白表达和转位。结果(1)IHG组和SHG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达及ROS水平增加,分别为NG组的1.29倍、2.32倍、3.21倍和1.17倍、1.63倍、1.75倍,且IHG组增加更明显(P值均<0.05)。(2)IHG组和SHG组PKCβ2核转位激活,定量分析显示胞浆/胞核荧光强度比值较NG组分别下降了21%和26%,且IHG组下降更加明显(P值均<0.05);IHGB组PKCβ2核转位较IHG组更显著,胞浆/胞核荧光强度比值为IHG组的75%,同时IHGB组VEGF、VCAM-1mRNA表达以及ROS水平亦显著高,分别为IHG组的1.16倍、1.26倍和1.25倍(P值均<0.05)。(3)IHGM组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平均较IHG组明显低,为IHG组的87%、76%和39%;IHGM组PKCβ2核转位亦较IHG组减少,胞浆/胞核荧光强度比值为IHG组的1.09倍(P值均<0.05)。结论波动性高糖较持续性高糖更易损伤HUVECs,这与PKCβ2活化密切相关;二甲双胍可能通过抑制PKCβ2激活,减轻波动性高糖诱导的HUVECs损伤。

全文目录

英汉缩略语名词对照  6-8
中文摘要  8-13
英文摘要  13-20
研究背景  20-29
第一部分蛋白激酶Cβ_2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤  29-56
  前言  29
  1 材料和方法  29-41
  2 结果  41-48
  3 讨论  48-51
  结论  51-52
  参考文献  52-56
第二部分蛋白激酶Cβ_2-活性氧交互环介导高糖致人内皮细胞损伤记忆效应  56-73
  前言  56
  1 材料和方法  56-59
  2 结果  59-66
  3 讨论  66-68
  结论  68-69
  参考文献  69-73
第三部分高糖波动激活蛋白激酶 Cβ_2损伤人内皮细胞及二甲双胍的干预作用  73-89
  前言  73
  1 材料和方法  73-75
  2 结果  75-81
  3 讨论  81-83
  结论  83-84
  参考文献  84-89
文献综述  89-99
致谢  99-100
攻读硕士学位期间发表的论文  100

蛋白激酶Cβ_2在不同血糖模式致人内皮细胞损伤中的作用

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