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马氏珠母贝精子质量检测与评价方法的研究

作　者: 宾承勇
导　师: 余祥勇
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 马氏珠母贝精子活率精子形态质膜完整性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本论文以马氏珠母贝(Pinctada martensii)为研究对象,通过染色观察来检测其精子活率、形态及质膜结构的完整性。以期为精子质量检测方法在贝类上的运用提供基础数据,为贝类精子质量检测体系的建立提供参考。1.曙红Y染色法检测马氏珠母贝活精率的研究:取性腺发育良好的雄贝精液作为检测样品。选择曙红Y、结晶紫等几种常规染料对马氏珠母贝精子进行染色处理,初步筛选出能用于马氏珠母贝精子质量检测的染料。在筛选出适合染料后进一步研究染色液浓度及染色时间等指标,在此基础上对染液毒性、精子自然死亡率等指标进行检测,并对染色后的实际死亡率和“理论死亡率”进行相关性分析,总结分析出马氏珠母贝精子的最佳染色方法。结果发现:经曙红Y染色后,活精子不着色,死精子着红色。对染液毒性等指标进行检测后表明,曙红Y染色法可用于马氏珠母贝精子的检测与质量评价,该检测方法灵敏、准确,结果可靠。曙红Y染色最适染液浓度为0.04%(终浓度),染色时间以15min为最佳。2.两种染色方法评定马氏珠母贝精子形态效果比较:以不同方法来制作马氏珠母贝精液抹片,选择曙红Y及结晶紫染液对抹片进行染色处理,显微镜下对精子形态进行观察分类,并确定主要的畸形类型及各畸形的特点。结果发现:精液与2%曙红Y染液等比混合后抹片,精子头部着深红色,尾部着浅红色,背景为浅粉红色,对比明显,精子各部分结构清晰,形态特征明显,背景干净,易于观察。在制好的精液压片边缘滴加0.5%的结晶紫染液,使用渗透染色的方法使染料渗入且均匀分布,再拉开或揭开两张玻片,得到两张精子抹片,干燥后显微镜下精子头部着深紫色,尾部着浅紫色,背景颜色为淡粉红色,对比明显,各部分结构清晰,染色特征明显,可较准确的对精子形态特征作出判断。马氏珠母贝精子畸形主要集中在精子的颈部和尾部,头部畸形情况较少。检测结果显示两种染色方法均可用于其形态检测,但就制片难易程度而言,推荐使用曙红Y染色法。3.结晶紫水试验评价马氏珠母贝精子膜功能完整性的观察:吸取适量马氏珠母贝精液于干净玻片上,滴加一滴蒸馏水并混匀,加盖玻片后沿玻片边缘滴加适量0.5%结晶紫染液,在玻片另一端用吸水纸吸取染液,使染液均匀渗入玻片,于40×10倍显微镜下观察精子尾部的肿胀情况,并进行计数统计分析。同时使用曙红Y染色法检测精子活率来进行对比分析。结果显示:马氏珠母贝精液在蒸馏水中发生尾部肿胀现象,精子着深紫色,背景粉色,对比明显,易于观察。尾部肿胀率与曙红Y染色测得精子活率经差异性检验表明,二者之间并无显著性差异,即结晶紫水试验法适用于马氏珠母贝精子膜完整性的检测。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
1 前言  11-21
  1.1 双壳类精子质量评价研究现状  11-18
    1.1.1 精子活率检测  11-12
    1.1.2 精子形态检测  12-13
    1.1.3 精子质膜完整性  13-15
    1.1.4 精子线粒体活性检测  15-16
    1.1.5 精子顶体状态检测  16-17
    1.1.6 精子染色质结构检测  17-18
  1.2 研究目的和意义  18-21
    1.2.1 马氏珠母贝研究概况  18-19
    1.2.2 研究目的  19
    1.2.3 研究内容  19-21
2 曙红Y 染色法检测马氏珠母贝活精率的研究  21-29
  2.1 材料和方法  21-22
    2.1.1 精子的获得及样品的制备  21
    2.1.2 染液的配制及浓度设定  21
    2.1.3 精子的染色方法及判别指标  21-22
    2.1.4 染料毒性检测  22
    2.1.5 精子自然死亡率检测  22
    2.1.6 数据分析  22
  2.2 结果与分析  22-26
    2.2.1 精子的染色特征  22-23
    2.2.2 不同处理条件下检测精子死亡率结果比较  23-24
    2.2.3 理论死亡率和实测死亡率的相关性比较  24-25
    2.2.4 曙红Y 染液对精子毒性及精子室温下自然死亡率检测  25-26
  2.3 讨论  26-28
    2.3.1 精子质膜结构的完整性与染色  26
    2.3.2 死亡率变化趋势与染液浓度  26-27
    2.3.3 染料毒性及鲜精自然死亡率  27
    2.3.4 不同制片方法的比较  27-28
  2.4 本章小结  28-29
3 两种染色方法评定马氏珠母贝精子形态的效果比较  29-38
  3.1 材料和方法  29-30
    3.1.1 精子的获得  29
    3.1.2 抹片制作  29-30
    3.1.3 染色方法  30
    3.1.4 数据分析  30
  3.2 结果与分析  30-35
    3.2.1 不同染色方法的染色效果  30-32
    3.2.2 精子的正常形态及各种畸形  32-34
    3.2.3 不同染色方法效果比较  34-35
  3.3 讨论  35-36
    3.3.1 精子形态分类及评估标准  35
    3.3.2 涂片对精子形态的影响  35-36
    3.3.3 染色方法的比较  36
  3.4 本章小结  36-38
4 结晶紫水试验评价马氏珠母贝精子膜功能完整性的观察  38-43
  4.1 材料和方法  38-39
    4.1.1 精子的获得  38
    4.1.2 染液的配制  38
    4.1.3 结晶紫水试验法  38-39
    4.1.4 曙红Y 染色法  39
    4.1.5 数据分析  39
  4.2 结果与分析  39-41
    4.2.1 水试验后精子尾部肿胀类型  39-40
    4.2.2 精子尾部水试验与曙红 Y 染色试验结果比较  40-41
  4.3 讨论  41-42
    4.3.1 精子膜结构的完整性与肿胀  41-42
    4.3.2 精子肿胀形态及分类标准  42
    4.3.3 制片方法对结果的影响  42
  4.4 本章小结  42-43
参考文献  43-51
致谢  51-52
导师简介  52
作者简介  52

马氏珠母贝精子质量检测与评价方法的研究

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