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红笛鲷NCCRP-1基因的克隆和表达分析
作 者: 魏世娜
导 师: 简纪常;吴灶和
学 校: 广东海洋大学
专 业: 水产养殖
关键词: 红笛鲷 NCCRP-1 RACE 原核表达 荧光定量PCR
分类号: S917.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 34次
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内容摘要
鱼类的非特异性细胞毒性细胞(NCC)在进化上是自然杀伤细胞(NK)的前体细胞,与NK细胞的功能等同,而且这种免疫细胞从鱼类到哺乳动物的进化是保守的。NCC主要来源于血液和淋巴器官,是鱼类防御病毒、细菌、寄生性原生动物等入侵的第一道防线,在鱼类非特异性免疫中起重要作用。目前的研究表明NCCRP-1受体蛋白位于NCC膜上,在鱼类炎症反应中可能通过颗粒胞吐途径参与抗菌的先天性免疫。NCCRP-1是NCC发挥功能的分子基础,在识别靶细胞和细胞毒性激活方面起着重要的作用。本论文以我国南方主要海水养殖鱼类之——红笛鲷(Lutjanus sanguineus)为研究对象,对红笛鲷NCCRP-1基因进行克隆和表达。用生物信息学方法对鱼类已知的NCCRP-1基因进行序列比对,根据序列保守区域设计并合成简并引物。从红笛鲷头肾组织中提取总RNA,应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,获得NCCRP-1基因全长cDNA序列。NCCRP-1基因全长为980 bp,完整开放阅读框(ORF)为702 bp,编码233个氨基酸,5′非编码区为42 bp,3′非编码区为236 bp。红笛鲷NCCRP-1与金头鲷NCCRP-1的同源率最高,为84%,而与哺乳动物NCCRP-1的同源率相对较低。将NCCRP-1基因与原核表达载体pET-21a进行连接,构建重组表达载体,然后转入E.coli BL21内进行诱导表达。在IPTG的浓度为0.8 mmol/L、37℃培养3 h条件下,目的基因表达效果最佳。本研究成功获得了高表达的重组目的蛋白,分子量与预期值相符,融合蛋白主要以包涵体形式存在,通过HisTrap HP柱子纯化融合蛋白。Western blot分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合,确切表明所表达出的蛋白为目的蛋白。应用Real-time PCR技术,以β-actin和GAPDH基因为内参,研究了NCCRP-1基因在感染溶藻弧菌后红笛鲷头肾、胸腺、肝脏、脾脏、心脏、鳃、肌肉和肠8个组织中的表达特性,分析了不同温度、盐度刺激4h后头肾组织中NCCRP-1基因的表达差异,实验结果表明,红笛鲷经溶藻弧菌感染4h后NCCRP-1基因在8个组织内均有表达,但在头肾中表达量最大,其次是在脾脏、肝脏,再次是在肌肉、鳃、胸腺和心脏,在肠中表达量最低;在温度22℃、盐度20的条件下,头肾组织中NCCRP-1基因的表达量较大。本论文的研究为红笛鲷疾病防治提供了一定的理论依据,丰富和发展了鱼类分子免疫学的研究内容,为进一步研究NCCRP-1蛋白的生物学特性以及在鱼类先天性免疫中的功能研究奠定基础。
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全文目录
摘要 5-6 ABSTRACT 6-10 1 文献综述 10-17 1.1 鱼类免疫系统研究进展 10-14 1.1.1 鱼类免疫系统的组织和器官 10-11 1.1.2 细胞免疫 11-12 1.1.3 体液免疫 12-14 1.1.4 鱼类的免疫应答及其调节 14 1.2 鱼类NCCRP-1 的研究进展 14-15 1.3 本文研究的目的意义 15-17 2 红笛鲷NCCRP-1 基因的克隆 17-30 2.1 材料、试剂及仪器 17-18 2.1.1 菌株和实验用鱼 17 2.1.2 主要试剂、工具酶及试剂盒 17 2.1.3 主要溶液 17 2.1.4 仪器 17-18 2.2 实验方法 18-24 2.2.1 红笛鲷总RNA 的提取 18 2.2.2 红笛鲷NCCRP-1 基因的RACE 克隆 18-24 2.2.3 NCCRP-1 基因的序列分析 24 2.3 结果 24-28 2.3.1 红笛鲷总RNA 的提取 24-25 2.3.2 红笛鲷NCCRP-1 基因的3′端及5′端片段的电泳结果 25-26 2.3.3 核苷酸序列分析 26-27 2.3.4 氨基酸序列分析 27 2.3.5 NCCRP-1 基因的同源性分析及系统树的构建 27-28 2.4 讨论 28-30 3 红笛鲷NCCRP-1 基因的原核表达 30-43 3.1 材料与方法 30-35 3.1.1 材料 30-32 3.1.2 方法 32-35 3.2 结果与分析 35-41 3.2.1 表达载体的构建 35-37 3.2.2 重组红笛鲷NCCRP-1 基因在大肠杆菌中的表达分析 37-41 3.3 讨论 41-43 4 NCCRP-1 基因在红笛鲷中表达差异的研究 43-48 4.1 实验材料 43 4.2 实验方法 43-44 4.2.1 溶藻弧菌的培养 43 4.2.2 红笛鲷的暂养及样品采集 43 4.2.3 Trizol 法提取总RNA 及cDNA 一链合成 43 4.2.4 NCCRP-1 基因表达的实时荧光定量PCR 分析 43-44 4.3 实验结果 44-46 4.3.1 溶藻弧菌感染后NCCRP-1 基因在头肾中的时间表达差异 44 4.3.2 溶藻弧菌感染后NCCRP-1 基因的组织表达差异 44-45 4.3.3 不同温度、盐度下NCCRP-1 基因在头肾中的表达差异 45-46 4.4 讨论 46-48 5 结论 48-49 参考文献 49-55 致谢 55-56 作者简历 56-57 导师简介 57
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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