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军曹鱼对溶藻弧菌疫苗的免疫应答及其血清免疫球蛋白的初步研究

作　者: 黄秋石
导　师: 陈刚；张健东
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 军曹鱼免疫球蛋白纯化亲和层析溶藻弧菌疫苗免疫应答
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

军曹鱼因其个体大、生长快、适应高密度养殖等特点已逐渐成为我国南方沿海网箱养殖及池养的一个重要品种。但是,近些年来随着养殖规模的倍增和养殖环境的恶化,军曹鱼的疾病危害也日趋严重。溶藻弧菌则是海水鱼类弧菌病害的主要病原。目前,疫苗接种正逐渐成为为一种崭新的疾病防治手段,在水产渔业中正发挥着日益积极的作用。本文以军曹鱼为研究对象,应用生物化学技术、免疫学技术等试验方法对军曹鱼的免疫系统及其应答规律进行了初步的研究,完成了军曹鱼血清免疫球蛋白的纯化及亚单位分子量的测定,军曹鱼对溶藻弧菌疫苗的非特异性免疫应答和特异性免疫应答等方面内容的研究,获得的主要结果如下:1.应用山羊IgG作为抗原注射免疫军曹鱼以获得免疫血清,采用饱和硫酸铵分步盐析和免疫亲和层析相结合的方法,纯化了军曹鱼血清免疫球蛋白(Ig),结果显示:盐析血清Ig最理想的硫酸铵饱和度为40～50%;亲和层析能分离到两个明显独立的层析峰,且血清Ig存在于第Ⅱ层析峰中。SDS-PAGE显示第Ⅱ层析峰中仅现两条蛋白带,证明纯化的血清Ig具有较高的纯度,其L、H链分子量分别为28.4kD和77.2kD;如果军曹鱼血清Ig也像大多数硬骨鱼类Ig M那样在自然状态下为四聚体,则其分子量理论值为844.8kD。将制备的军曹鱼血清作为免疫原,用于免疫新西兰大白兔,制备了兔抗军曹鱼血清的多克隆抗体,间接ELISA测得多克隆抗体的效价至少为5120。2、应用106 CFU·mL-1、108CFU·mL-1、1010 CFU·mL-1三个浓度梯度的溶藻弧菌疫苗注射免疫军曹鱼幼鱼,通过检测血液免疫细胞的数量、头肾及脾脏指数、血清非特异性体液因子的活性,研究了军曹鱼幼鱼对溶藻弧菌疫苗的非特异性免疫应答反应。结果显示:幼鱼对三个浓度组的菌苗都产生了免疫应答,各免疫组幼鱼的血液白细胞(WBC)及分类的数量(DLC),头肾及脾脏指数,血清碱性磷酸酶活性(AKP)、超氧化物歧化酶活性(SOD)、溶菌酶活性(LSZ)、抗菌活力、补体C3含量和C-反应蛋白含量,在首次免疫和加强免疫后的第7天均显著高于生理盐水(PBS)对照组。研究结果表明了军曹鱼幼鱼能够对溶藻弧菌疫苗的注射免疫产生非特异性免疫应答,且应答强度在注射免疫后的第7天为最强。3.应用106 CFU·mL-1、108CFU·mL-1、1010 CFU·mL-1三个浓度梯度的溶藻弧菌疫苗注射免疫军曹鱼幼鱼,通过ELISA检测血清抗体效价的动态变化,免疫后第28天采用人工感染溶藻弧菌活菌检测免疫幼鱼的免疫保护率(RPS),研究了军曹鱼幼鱼对溶藻弧菌疫苗的特异性免疫应答反应。结果显示:军曹鱼幼鱼对三个浓度组的菌苗都产生了免疫应答,免疫组鱼血清的抗体效价随免疫时间推进而上升,免疫后第21天分达最高值28.2,210.8和29.2,且在第28天仍能维持在较高的水平;攻毒试验测得各疫苗浓度免疫组幼鱼的RPS分别为64.71%,82.35%,70.59%。研究结果表明了军曹鱼幼鱼能够对溶藻弧菌疫苗的注射免疫产生特异性免疫应答,且应答强度以疫苗浓度108CFU·mL-1、第21天为最强。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
1 文献综述  12-21
  1.1 鱼类免疫系统的研究概况  12-17
    1.1.1 动物免疫系统简介  12-13
    1.1.2 鱼类的免疫器官组织  13-14
    1.1.3 鱼类的免疫细胞  14
    1.1.4 鱼类非特异性体液因子  14-15
    1.1.5 鱼类特异性抗体  15-17
  1.2 鱼用疫苗研究的现状  17-19
    1.2.1 鱼用疫苗的种类  17
    1.2.2 鱼用疫苗的接种途径  17
    1.2.3 鱼用疫苗的效果评价  17-18
    1.2.4 影响疫苗效果的因素  18-19
  1.3 本研究的对象、内容、目的及意义  19-21
    1.3.1 研究对象  19
    1.3.2 研究内容  19
    1.3.3 研究背景、目的及意义  19-21
2 军曹鱼血清免疫球蛋白的初步研究  21-30
  2.1 材料  21-23
    2.1.1 主要仪器  21
    2.1.2 主要试剂  21-23
    2.1.3 试验用鱼及管理  23
    2.1.4 试验用兔及饲养  23
  2.2 方法  23-25
    2.2.1 成鱼的免疫  23
    2.2.2 采血及血清的制备  23
    2.2.3 抗体效价水平的鉴定  23-24
    2.2.4 血清Ig 的分离和纯化  24
    2.2.5 血清Ig 亚单位分子量及纯度鉴定  24
    2.2.6 兔抗军曹鱼血清的多克隆抗体的制备  24-25
    2.2.7 ELISA 法测定兔抗血清的效价  25
  2.3 结果  25-28
    2.3.1 抗体效价水平的鉴定  25-26
    2.3.2 血清Ig 的分离纯化  26
    2.3.3 血清IgM 的分子量与纯度鉴定  26-27
    2.3.4 兔抗军曹鱼血清多克隆抗体效价的测定  27-28
  2.4 讨论  28-30
3 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼非特异性免疫功能的影响  30-43
  3.1 材料  30-31
    3.1.1 主要仪器  30
    3.1.2 主要试剂  30-31
    3.1.3 试验用鱼及管理  31
  3.2 方法  31-32
    3.2.1 菌苗的制备  31
    3.2.2 幼鱼的注射免疫  31
    3.2.3 采血及血样的处理  31-32
    3.2.4 非特异性免疫指标的测定  32
    3.2.5 数据处理与统计分析  32
  3.3 结果  32-39
    3.3.1 免疫血细胞数量的检测结果  32-34
    3.3.2 免疫器官指数的测定结果  34-35
    3.3.3 非特异性体液因子的测定结果  35-39
  3.4 讨论  39-43
    3.4.1 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼免疫血细胞计数的影响  39-40
    3.4.2 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼免疫器官指数的影响  40
    3.4.3 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼血清AKP 活性的影响  40
    3.4.4 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼血清SOD 活性的影响  40-41
    3.4.5 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼血清LSZ 活性的影响  41
    3.4.6 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼血清抗菌活力的影响  41
    3.4.7 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼血清补体C3 含量的影响  41-42
    3.4.8 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼血清C-反应蛋白含量的影响  42-43
4 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼特异性免疫功能及生长的影响  43-49
  4.1 材料  43
    4.1.1 主要仪器  43
    4.1.2 主要试剂  43
    4.1.3 试验用鱼及管理  43
  4.2 方法  43-44
    4.2.1 菌苗的制备  43
    4.2.2 幼鱼的免疫接种  43
    4.2.3 采血及免疫血清的制备  43
    4.2.4 ELISA 测定血清特异性抗体滴度  43-44
    4.2.5 攻毒试验测疫苗对幼鱼的相对免疫保护率  44
    4.2.6 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼生长状况的影响  44
    4.2.7 数据处理与统计分析  44
  4.3 结果  44-48
    4.3.1 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼血清特异性抗体滴度的影响  44-46
    4.3.2 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼抗病力的影响  46-47
    4.3.3 溶藻弧菌疫苗对军曹鱼生长状况的影响  47-48
  4.4 讨论  48-49
5 结论  49-50
参考文献  50-56
致谢  56-57
作者简介  57-58
导师简介  58

军曹鱼对溶藻弧菌疫苗的免疫应答及其血清免疫球蛋白的初步研究

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