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基于逆转录病毒载体的表达克隆法的建立

作　者: 曲栗
导　师: 李德山
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 表达克隆系统 MACS/FACS 高通量筛选 cDNA文库 CD28 ICOS
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

21世纪初,在人类基因组序列完成之后,对基因功能的研究显得日益重要,发现基因的受体将对了解基因的功能和作用机理起到至关重要的作用。与目前常规应用的细胞模型和动物模型不同,本研究从寻找基因受体入手从而开启研究新基因功能的大门。配体/受体可在体内外相互作用,虽然配体/受体的亲和力不同,但大多数情况下配体/受体反应可在体外通过标记配体或受体而检测出来。本研究建立的高通量表达克隆系统(expression cloning system)是一种快速、灵敏、高通量的筛选系统,它可用于分离、筛选受体和膜结合配体,该系统是以高效表达的逆转录病毒载体为核心,以高通量的磁力筛选法(Magnetic Cell Sorter, MACS)和高精密度的流式细胞仪分选法(Fluorescence-Activated Cell Sorter, FACS)相结合的独特的筛选方法。主要依据是配体／受体的相互结合,然后通过磁力分离和流式细胞仪分选将阳性细胞从众多的阴性细胞中分离出来,再从扩增的阳性细胞中分离和鉴定受体基因。具体方法是将已知的配体经Fc标记后作为诱饵,再与Protein G标记的磁珠结合,磁珠的特点是非常微小,相当于一个病毒颗粒,当配体蛋白结合到宿主细胞表面表达的受体上时,该细胞将停留在磁场中,从而与非受体表达细胞分开。MACS的优点是效率高,可同时操作上亿细胞,如此大量的细胞是无法直接在分选型流式细胞仪上操作的,所以经MACS筛选到的阳性细胞增殖后,再次用同一配体孵育,用更精确的流式细胞仪分选,直至完全纯化,受体基因将用与载体互补的引物,经PCR方法克隆。利用该系统具有很好的灵敏度,可以从106个细胞中筛选出低至2个表达受体的阳性细胞。为验证该系统的可行性,应用该系统在相应的cDNA文库中筛选到了2个已知基因的细胞受体：应用配体B7-H2蛋白作为诱饵,从活化的人T淋巴细胞cDNA文库中筛选到其受体ICOS(inducible co-stimulator),最终,从纯化的受体表达细胞中分离出受体基因;应用配体B7-1蛋白作为诱饵,从活化的人T淋巴细胞cDNA文库中筛选其功能受体CD28,并使用CD28的另一配体蛋白：B7-2和人IgG,来鉴定筛选结果的特异性。这些结果表明,该表达克隆系统适合于大规模分离受体和膜结合配体,为后基因组时代研究基因的功能和作用机理提供了有效方法,该系统使应用筛选受体方法研究新基因的功能成为可能。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-13
1 引言  13-25
  1.1 发现新基因或新的靶基因的现状  13-14
  1.2 发现药物基因或药物靶基因的方法  14-15
  1.3 表达克隆法简介  15-16
  1.4 逆转录病毒表达克隆系统  16-23
    1.4.1 逆转录病毒载体系统  17-19
    1.4.2 cDNA文库的构建  19-21
    1.4.3 高通量的磁力细胞筛选法(MACS)与精确的流式细胞仪分选法(FACS)  21-23
  1.5 ICOS、CD28简介  23-24
    1.5.1 ICOS  23-24
    1.5.2 CD28  24
  1.6 本研究的目的、意义与创新点  24-25
2 材料  25-27
  2.1 实验材料  25
  2.2 主要药品及试剂  25
  2.3 实验主要仪器设备  25-27
3 方法  27-42
  3.1 逆转录病毒cDNA文库的构建  27-33
    3.1.1 人T淋巴细胞的分离与活化  27
    3.1.2 活化的人T淋巴细胞总RNA的提取  27-28
    3.1.3 活化的人T淋巴细胞mRNA的分离  28
    3.1.4 第一链cDNA的合成  28-29
    3.1.5 第二链cDNA的合成及末端平滑化  29-30
    3.1.6 cDNA片段与接头的连接、限制性酶酶切、胶回收去小片段  30-31
    3.1.7 pBMN-IRES-EGFP逆转录病毒载体的制备  31-32
    3.1.8 胶回收cDNA片段与pBMN-IRES-EGFP逆转录病毒载体连接  32
    3.1.9 E.coli DH5α电转化感受态细胞的制备  32
    3.1.10 人T淋巴细胞逆转录病毒cDNA文库的电转化  32-33
    3.1.11 人T淋巴细胞逆转录病毒cDNA文库质量的鉴定与扩增  33
  3.2 产生重组逆转录病毒包装细胞系的培养  33-35
    3.2.1 293-EcoPack细胞复苏  33-34
    3.2.2 293-EcoPack细胞传代  34
    3.2.3 293-EcoPack细胞冻存  34-35
  3.3 宿主细胞BaF3的培养  35
    3.3.1 WEHI细胞的培养  35
    3.3.2 BaF3的培养  35
  3.4 逆转录病毒文库转染293-EcoPack细胞  35-37
    3.4.1 质粒的准备  35-36
    3.4.2 cDNA文库转染293-EcoPack细胞  36-37
  3.5 逆转录病毒感染BaF3细胞  37
  3.6 高通量MACS/FACS表达克隆筛选系统筛选并鉴定ICOS  37-40
    3.6.1 MACS粗筛选ICOS  37-38
    3.6.2 FACS精筛选ICOS  38-39
    3.6.3 鉴定表达ICOS的细胞  39-40
  3.7 高通量MACS/FACS表达克隆筛选系统灵敏度的检测  40
  3.8 利用高通量MACS/FACS表达克隆筛选系统筛选并鉴定CD28  40-42
    3.8.1 MACS/FACS筛选CD28  40-41
    3.8.2 鉴定表达CD28的细胞  41-42
4 实验结果  42-57
  4.1 逆转录病毒cDNA文库的构建  42-46
    4.1.1 活化的人T淋巴细胞总RNA的提取  42
    4.1.2 活化的人T淋巴细胞mRNA的分离  42-43
    4.1.3 第一链cDNA的合成  43-44
    4.1.4 第二链cDNA的合成  44
    4.1.5 pBMN-IRES-EGFP逆转录病毒载体的制备  44-45
    4.1.6 逆转录病毒cDNA文库质量鉴定  45-46
  4.2 逆转录病毒文库转染293-EcoPack细胞  46-48
  4.3 重组逆转录病毒感染BaF3细胞  48
  4.4 高通量MACS/FACS表达克隆筛选系统筛选并鉴定ICOS  48-51
  4.5 高通量MACS/FACS表达克隆筛选系统灵敏度的检测  51-54
  4.6 高通量MACS/FACS表达克隆筛选系统筛选并鉴定CD28  54-57
    4.6.1 MACS/FACS筛选CD28  54-55
    4.6.2 鉴定表达CD28的细胞  55-57
5 讨论  57-62
  5.1 逆转录病毒cDNA文库的构建  57-60
    5.1.1 人白细胞的收集  57
    5.1.2 总RNA的提取  57-58
    5.1.3 高质量的mRNA的提取  58-59
    5.1.4 第一链cDNA的合成  59
    5.1.5 制备E.coli DH5α电转化感受态细胞  59
    5.1.6 逆转录病毒文库电转化效率  59-60
  5.2 逆转录病毒载体的选择  60
  5.3 包装细胞的最佳密度  60
  5.4 高通量的磁力细胞筛选法(MACS)与精确的流式细胞仪分选法(FACS)  60-62
6 结论  62-63
致谢  63-64
参考文献  64-74
附录A  74-75
附录B  75-77
攻读硕士学位期间发表的学术论文  77

基于逆转录病毒载体的表达克隆法的建立

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