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鲤鱼雌激素受体的分离纯化及其与邻苯二甲酸酯的相互作用研究

作　者: 康丹妮
导　师: 赵晓祥
学　校: 东华大学
专　业: 环境科学
关键词: 邻苯二甲酸酯十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳电洗脱表面等离子共振傅里叶变换红外光谱
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

邻苯二甲酸酯类物质是近几年来倍受关注的一类环境雌激素物质,这类物质在全球范围内具有非常大的使用量,且有许多人类长期使用的物质中都含有该类物质,如塑料袋、化妆品、医用器械,更有甚在近年来还发现其被作为食品添加剂而使用。在正常使用中,该类物质主要是作为增塑剂使用,但由于其与聚氯乙烯等的结合主要是靠氢键和范德华力,随着使用时间的延长就溶液从塑料中渗漏出来,对水体、土壤等环境介质造成污染,甚至直接对人类本身造成危害,已是一种无处不在的污染,且具有持久的环境效应。近年来有研究表明,该类物质对人类及动物的肝脏、生殖系统、免疫系统等具有一定的毒性作用,最直接的便是内分泌干扰效应,并具有一定的远期毒性效应。目前已有美国、日本,以及我国等多个国家将其列为优先监控的污染物。雌激素类物质的危害作用主要是通过先与动物体内相应的受体相互作用,进而发挥其毒性作用。本文通过体外实验方法,对邻苯二甲酸酯类物质在水体中对鱼类的作用机制作初步探讨,并为将来的研究工作打下基础。以邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)为邻苯二甲酸酯类物质的代表物,将其投入到饲养鲤鱼的水中,诱导鲤鱼肝脏中产生更多的雌激素受体,然后经过高速离心的方法对受体进行初级分离,再采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)结合电洗脱的方法,获得了纯度较高的受体。SDS-PAGE的实验条件为：5%浓缩胶,12%分离胶,样品在浓缩胶内移动时电压采用80V,而当样品移至分离胶时,电压调整为120V,并且电泳全过程在冰浴中进行。电洗脱过程采用的是常规电泳仪,以含50mmol/L Tris,50mmol/L甘氨酸,0.1% SDS,pH8.9的Tris-甘氨酸缓冲液作为电洗脱液,洗脱电压为100V,洗脱3h,可得纯度高达88.5%的受体,且每10块胶约能回收2.1mg的受体。该法操作非常简便,无需配置专门的电洗脱装置,回收率高,纯化效果好,且适用的蛋白范围广,尤其对于分离纯化样品中含量少,或与其它蛋白分子量相近的的蛋白质十分有效。本文采用分子自组装技术,以3-巯基丙酸为链接单分子层,将链酶亲和素(SA)链接到巯基单分子层上,再固定上70μL纯化后的受体,得到本实验所需的特异性芯片,再使用表面等离子共振仪(SPR)对受体与DBP的结合情况进行实验研究,结果表明,分离出的该受体能与DBP发生特异性结合,且随着DBP浓度的增大二者结合量也随之增大,当DBP浓度达到1×10-9g/L时,受体的结合位点已趋近饱和,且二者能稳定结合。本文进一步采用傅里叶变换红外光谱对二者的相互作用进行探讨,通过实验发现,当受体与DBP结合后,受体的结构受到了明显的影响,其结构改变主要发生在酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅲ带、指纹区以及酰胺V带处。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-13
第一章绪论  13-25
  1.1 环境雌激素  13-15
    1.1.1 环境雌激素的分类  13
    1.1.2 环境雌激素的特点  13-14
    1.1.3 环境雌激素的作用机制  14-15
    1.1.4 环境雌激素的危害  15
  1.2 邻苯二甲酸酯  15-19
    1.2.1 邻苯二甲酸酯理化性质  15-17
    1.2.2 邻苯二甲酸酯毒性与危害  17-19
    1.2.3 中国水环境中邻苯二甲酸酯的污染现状  19
  1.3 鲤鱼在邻苯二甲酸酯类毒理实验中的应用  19-20
  1.4 雌激素受体的分离纯化及其表征  20-22
    1.4.1 雌激素受体  20
    1.4.2 雌激素受体的分离纯化方法  20-22
  1.5 受体与配体的相互作用  22-23
  1.6 课题研究意义、研究内容以及创新点  23-25
    1.6.1 课题的研究背景及意义  23-24
    1.6.2 课题研究的内容  24
    1.6.3 课题的创新点  24-25
第二章实验设计  25-33
  2.1 实验材料  25-28
    2.1.1 实验仪器  25-26
    2.1.2 实验药品及试剂  26-28
    2.1.3 供试动物及驯养  28
  2.2 实验方法  28-33
    2.2.1 受体的分离纯化方法选择  28-29
    2.2.2 受体的纯度鉴定方法  29-30
    2.2.3 蛋白质含量的测定方法  30-31
    2.2.4 受体-配体相互作用的研究方法  31-33
第三章鲤鱼雌激素受体的分离纯化  33-45
  3.1 前言  33-35
    3.1.1 十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳  33-35
  3.2 实验步骤  35-39
    3.2.1 受体的初级分离  35
    3.2.2 受体的高效分离纯化  35-38
    3.2.3 受体纯度鉴定  38
    3.2.4 受体含量的测定  38-39
  3.3 实验结果  39-43
    3.3.1 凝胶过滤  39-40
    3.3.2 SDS-PAGE  40-41
    3.3.3 电洗脱后纯度鉴定  41-42
    3.3.4 蛋白质含量的测定结果  42-43
  3.4 分析与讨论  43-44
  3.5 本章小结  44-45
第四章雌激素受体-配体相互作用研究  45-60
  4.1 前言  45-49
    4.1.1 表面等离子共振(SPR)技术  45-46
    4.1.2 金属芯片的制备  46-47
    4.1.3 傅里叶变换红外光谱  47-49
  4.2 实验步骤  49-51
    4.2.1 芯片的制备  49
    4.2.2 SPR检测受体与配体间的相互作用  49-51
    4.2.3 傅里叶变换红外光谱检测  51
  4.3 实验结果  51-57
    4.3.1 雌激素受体的固定  51-52
    4.3.2 SPR检测雌激素受体与DBP的相互作用  52-54
    4.3.3 傅里叶变换红外光谱检测受体结构及其与DBP的相互作用  54-57
  4.4 分析与讨论  57-58
  4.5 本章小结  58-60
第五章结论与展望  60-62
  5.1 结论  60-61
  5.2 展望  61-62
参考文献  62-67
攻读硕士学位期间发表的论文  67-68
致谢  68

鲤鱼雌激素受体的分离纯化及其与邻苯二甲酸酯的相互作用研究

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