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羟基喜树碱脑植入缓释片的神经毒性研究

作　者: 唐华非
导　师: 刘松青
学　校: 第三军医大学
专　业: 药剂学
关键词: 羟基喜树碱缓释片聚乳酸大脑皮层神经元大脑皮层星形胶质细胞神经毒性
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景:羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin,HCPT)是从珙桐科植物喜树(Camptotheca acuminata Decne)中提取得到的一种吲哚类生物碱,具有广泛的抗肿瘤活性,且与其它抗肿瘤药物无交叉耐药性。HCPT可选择性抑制拓朴异构酶而干扰DNA的复制,为拓扑异构酶Ⅰ特异性抑制剂。HCPT的抗癌作用与抗代谢药及烷化药不同,HCPT作用于S期细胞,为细胞周期性特异药物。对S期的作用较G1,G2期明显,对G0期细胞无作用。在较高浓度时对核分裂有抑制作用,阻止细胞进入分裂期。脑胶质瘤(Glioma)是神经外科难治性疾病之一,术后常易复发,因此术后化疗成为脑胶质瘤辅助治疗的重要手段。由于血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的存在,多数化疗药物常规静脉给药后,难以在脑内达到有效浓度,若加大给药量又会导致全身性毒副作用的增加。近年来,间质化疗在脑胶质瘤治疗领域引起了广泛的关注,已成为脑胶质瘤治疗的重要手段。脑植入剂作为脑部间质化疗的一种新型制剂,不仅可以使化疗药物避开血脑屏障,直接作用于肿瘤组织,减少对正常组织的毒副作用,还具有缓控释特性,使药物能够在病变部位较长时间维持在有效治疗浓度,取得了较好的临床效果。本课题组前期采用聚乳酸(polylactic acid, PLA)为缓释材料,研制了HCPT脑内植入缓释片,并对其治疗大鼠实验脑胶质瘤的疗效进行了研究,显示HCPT缓释片脑内植入治疗能明显延长荷瘤大鼠的生存期。但HCPT脑内植入缓释片植于脑内后,在抑制肿瘤细胞增殖的同时,对大鼠的毒性的大小,特别是对脑组织的损伤程度是决定是否对该制剂进一步研究的重要因素,本实验拟对HCPT脑内植入缓释片的毒性进行研究,为该制剂进一步开发奠定基础。实验目的:(1)探讨大鼠大脑皮层神经细胞的体外培养方法,并对其形态学进行观察;(2)HCPT缓释片对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞进行干预,观察是否具有细胞毒性作用;(3)在体考察HCPT缓释片对大鼠大脑组织结构和功能的损伤;(4)在体考察HCPT缓释片对大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺以及肾脏组织的损伤;(5)在体考察HCPT缓释片对大鼠骨髓的抑制作用。(6)在体考察HCPT缓释片对胎鼠的致畸毒副作用及对胎鼠脑组织结构的影响。实验方法:(1)取新生SD乳大鼠的大脑皮层组织,采用胰酶消化、筛网过滤、离心等技术获取大脑皮层神经细胞并进行培养;(2)通过倒置显微镜、免疫细胞化学等方法对SD乳大鼠大脑皮层神经细胞进行定性和定量鉴定;(3)采用CCK-8检测HCPT对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞的毒性;(4)采用Hoechst33258染色检测HCPT致体外培养大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的程度;(5)将不同剂量的HCPT缓释片植入大鼠脑内,分别取30d和120d的实验大鼠,灌注后,取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺以及肾脏组织,通过石蜡切片、HE染色观察各组织的形态结构变化;(6)分别对术后30d和120d实验大鼠脑组织标本进行Nissl染色,观察神经元胞浆内尼氏体的数量,评价神经元蛋白合成的能力;(7)分别对术后30d和120d实验大鼠脑组织标本进行TUNEL染色,观察受损脑组织神经元的凋亡比例;(8)取术后30d大鼠股骨骨髓,涂片后进行瑞氏染色(wright’s stain),观察有核细胞的比例。(9)将HCPT缓释片植入孕鼠脑内,在分娩1d时取孕大鼠及胎鼠脑组织,通过神经元体外原代培养、HE染色观察脑组织神经元的形态结构变化;实验结果:(1)经形态学、免疫细胞化学(NSE)鉴定所培养的大鼠大脑皮层神经元并鉴定其纯度大于95%;(2)CCK-8检测结果显示,①PLA对体外原代培养的大脑皮层神经元和星形胶质细胞生长影响不明显;②体外原代培养的大鼠大脑皮层神经元经以40μg/ml HCPT处理24h后,与正常对照组比较,细胞活性显著降低(P<0.05);HCPT浓度达到320μg/ml时,降低程度十分显著(P<0.01);③体外原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞经20μg/ml HCPT处理24h后,与正常对照组比较,细胞活性显著降低(P<0.05);浓度达到80μg/ml时,降低程度十分显著(P<0.01);④体外模拟HCPT缓释片处理神经细胞较单独使用HCPT,对细胞的毒性更明显。(3)Hoechst33258染色结果显示,①PLA致体外原代培养大鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞凋亡不明显;②体外原代培养的大鼠大脑皮层神经元经80μg/ml HCPT处理24h后,与正常对照组比较,细胞活性显著降低(P<0.05);HCPT浓度达到160μg/ml时,降低程度十分显著(P<0.01);③体外原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞经40μg/ml HCPT处理24h后,与正常对照组比较,细胞活性显著降低(P<0.05);HCPT浓度达到80μg/ml时,降低程度十分显著(P<0.05);④体外模拟HCPT碱缓释片处理神经细胞较单独使用HCPT,细胞凋亡比例无显著差异。(4)经大鼠体内实验,大脑皮层组织免疫组化染色结果显示,PLA对皮层组织神经细胞的数量和活性没有显著的影响;HCPT缓释片对皮层组织神经细胞的数量和活性有一定的影响;低剂量HCPT缓释片植入大脑皮层后,与假手术组比较,脑组织未见病理学改变;高剂量HCPT缓释片对大脑皮层组织神经元的数量和活性具有显著影响。(5)经大鼠体内实验,HE染色显示,高剂量HCPT缓释片对肝脏具有一定的损伤,出现肝水肿,而心脏、脾脏、肺以及肾脏组织未见病理学改变。(6)经大鼠体内实验,瑞氏染色显示,未见HCPT缓释片骨髓抑制。(7)经神经元体外原代培养,模型组胎鼠神经元体外发育良好,与正常对照组比较未见形态学差异;经大鼠体内实验,HE染色显示,模型孕鼠脑组织有一定的炎症反应,而胎鼠脑组织未见病理学改变。结论:(1)采用无血清培养方法成功培养出了数量多、纯度高的大脑皮层神经元;(2)PLA对体外原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞和大鼠大脑皮层神经元毒性作用不显著。(3)HCPT对体外原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞和大鼠大脑皮层神经元均表现出一定的毒性作用,且对大鼠大脑皮层星形胶质细胞的毒性强于对大鼠大脑皮层神经元的毒性;(4)经大鼠体内实验,PLA空白片对脑组织结构和功能的损伤不显著;(5)经大鼠体内实验,HCPT缓释片对脑组织有一定的毒性,且随HCPT剂量的增加,毒性增大;低剂量和中剂量HCPT缓释片对心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏未见病理学改变;高剂量HCPT缓释片除对肝脏有一定的损伤外,对其它脏器组织未见病理学改变;(6)经大鼠体内实验,未见HCPT缓释片骨髓抑制。(7)经大鼠体内实验,HCPT缓释片对胎鼠脑组织未见毒性;

全文目录

英文缩写一览表  4-5
英文摘要  5-9
中文摘要  9-13
论文正文：羟基喜树碱脑植入缓释片的神经毒性研究  13-73
  前言  13-15
  第一部分 HCPT 脑植入缓释片对体外原代培养神经细胞的毒性研究  15-39
    1 实验材料  15-17
    2 实验方法  17-21
    3 实验结果  21-34
    4 讨论  34-37
    5 小结  37-39
  第二部分 HCPT 脑植入缓释片在体毒性研究  39-62
    1 实验材料  39-40
    2 实验方法  40-44
    3 实验结果  44-58
    4 讨论  58-61
    5 小结  61-62
  第三部分 HCPT 脑植入缓释片对胎鼠神经组织的毒性研究  62-67
    1 实验材料  62-63
    2 实验方法  63-64
    3 实验结果  64-66
    4 讨论  66
    5 小结  66-67
  全文结论  67-68
  致谢  68-69
  参考文献  69-73
文献综述 DNA 拓扑异构酶Ⅰ的研究现状  73-81
  参考文献  79-81
在读期间发表的文章  81

羟基喜树碱脑植入缓释片的神经毒性研究

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