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CHL瘤细胞与背景CD4~+T细胞关系的研究

作 者: 张艳
导 师: 赵彤
学 校: 南方医科大学
专 业: 病理学与病理生理学
关键词: 霍奇金淋巴瘤 背景T细胞 共培养 L428
分类号: R733.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


研究背景淋巴瘤也称恶性淋巴瘤,可原发于淋巴结和结外淋巴组织。由于淋巴细胞是机体免疫系统的主要成分,故淋巴瘤是机体免疫系统发生的一类恶性肿瘤。近年来淋巴瘤发病率有明显的上升趋势,因此得到了广泛的关注。淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)两大类型,后者是一种独特的淋巴瘤类型,1832年Thomas Hodgkin首先认识并描述了其形态特点。新WHO(2008)分类中,将HL分为五种亚型,其中结节硬化型(nodular sclerosis,NS),混合细胞型(mixed cellularity,MC),富于淋巴细胞型(lymphocyte-rich,LR),淋巴细胞消减型(lymphocyte depletion,LD)四个亚型属经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma,CHL);结节性淋巴细胞为主型(nodular lymphocyte predominance Hodgkin lymphoma,NLPHL)的瘤细胞特征性地表达B细胞的免疫表型而单独列出,以区别于CHL。其中CHL的发病率占到95%,以NSHL为首。HL的肿瘤细胞是一种独特的瘤巨细胞,分别由Sternberg(1898)和Reed(1902)首先描述,即R-S细胞(Reed-Sternberg cell,R-S cell),典型的R-S细胞为“镜影细胞”,另外具有与“镜影细胞”相似特征的单核瘤细胞称为霍奇金细胞(Hodgkin cell),因此HL的瘤细胞统称为HRS细胞。HL典型的组织学形态特点为HRS细胞在病变组织的所有细胞成分中仅占0.1%-10%,而且在不同亚型病例或同一病例不同进展时期时所占的数量和比例各异。瘤细胞周围为大量的背景细胞,包括T细胞、B细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等。背景细胞存在的意义目前仍有争议:认为这种炎症细胞反应可能是试图消灭肿瘤细胞的不成功尝试,也可能是由于HRS细胞需要依赖它们而生存和增生。这些背景细胞和细胞间质共同构成了HL的微环境。肿瘤细胞和微环境的关系越来越受到关注,组织结构场理论应运而生。该理论指出:肿瘤细胞和这个环境中的其它细胞及成分构成了一个微生态系统,肿瘤细胞的产生是微环境失调的结果;因此肿瘤的研究不仅要关注肿瘤细胞本身,更应重视微环境在肿瘤发生、发展过程中的作用。此理论在肿瘤研究实践中已经获得了足够的支持。上皮肿瘤微环境的研究认为癌上皮细胞和临近间质细胞的相互作用可导致肿瘤微环境体系的改变,并进而促进肿瘤的进程;上皮细胞起源的癌实际是由恶性上皮和永生改变化的癌相关成纤维细胞组成,这种癌相关成纤维细胞与良性增生的上皮细胞共培养时能够促进肿瘤发生,从而推断由原发性肿瘤分离的成纤维细胞在体内已经获得促进肿瘤进程的能力。大多数肿瘤细胞株的动物模型是通过裸鼠来实现的,但是部分细胞通过此途径不能实现,而通过提供微环境可得以实现。如非致瘤性的前列腺癌细胞系LNCaP和前列腺间质细胞移植至裸鼠的实验,结果显示:单独的LNCaP细胞或LNCaP和两种间质细胞不能形成肿瘤,而当LNCaP和三种间质细胞共移植会导致裸鼠有50-63%的成瘤率。另Kleinman等研究显示,非致瘤性NIH-3T3细胞当与再生的基底膜提取物基质胶共存时会使其表现出致瘤性和强的血管生成能力。在CHL微环境研究方面已经证实CHL细胞株和组织的HRS细胞不仅分泌CCL5,而且表达其受体CCR5。ALdinucci等利用纤维母细胞与HRS共培养后,HRS可以促进纤维母细胞分泌CCL5,同时CCL5-CCR5信号通路可以促进HRS形态的维持和增殖,提示了微环境中CCL5对HRS细胞的重要性。本课题组前期一直在尝试采用人CHL细胞株LA28建立动物模型,但在裸鼠和Balb/C鼠均未成功,究其原因可能与CHL的组织学特点为大量(约99%)的背景细胞和极少(约1%)的HRS瘤细胞组成的独特组织学特点有关,因此CHL的微环境引起了我们高度关注。为此本研究首先在病理组织学水平检测背景细胞的免疫表型,证实背景细胞多数是T细胞,且以CD4+T细胞为主。因此后续实验围绕L428与CD4+T的关系展开研究。重点运用共培养的方法,以背景中CD4+T细胞为主线,开展了其对CHL细胞株L428生物学活性影响的系列研究;同时检测L428对CD4+T细胞的趋化效应。双向研究以论证CHL瘤细胞与背景CD4+T的关系,为之后其动物模型的构建奠定基础。研究内容1.HL临床病理标本的背景T细胞相关表型分析应用免疫组化技术对CHL的背景细胞蛋白表型进行半定量分析,指标涉及T、B相关标记,CD4、CD8的分析和GrB、TIA-1的分析。2.CHL细胞株L428检测与鉴定从形态学和相关免疫标记两方面对L428进行检测。3.CD4+T淋巴细胞株Jurkat与L428共培养对L428的影响采用CD4+T淋巴细胞株Jurkat与L428进行间接和直接的共培养,对L428生长增殖指标的检测运用Notch1荧光定量,生长周期和MTT的方法;永生化B细胞与L428的共培养作为对照。4.含CD4+T的混合细胞与L428共培养对L428的影响为进一步说明CD4+T细胞共培养的效应,采用了HL好发部位淋巴结(Lymphonode, LN)混合细胞及正常人的T细胞占多数的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)混合细胞与L428进行共培养,对L428生长增殖相关指标的检测与上述相同。5.L428相关条件培养基对CD4+T细胞的趋化效应以L428上清、人CCL5细胞因子及其抗体的不同组合作为条件培养基(conditioned media,CM)来检测其对CD4+T细胞的趋化效应。主要方法1.免疫组化方法及计算机图像分析软件分析步骤:石蜡切片,常规脱蜡至水,微波抗原修复,分别滴加内源性过氧化物酶阻断剂、一抗、二抗复合物,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,中性树胶封固。同时应用计算机图像分析软件IPP6.0,计算对应二者免疫组化染色阳性指数(Positive Index, PI)之间的比值。2.L428形态学观察和免疫标识对L428细胞株形态进行倒置显微镜、甩片HE和蜡块HE的观察,蜡块切片做CD30、CD15、Mum-1等的标识。3.共培养实验分为三组:第一组为对照组,即单纯的L428;第二组为间接共培养组;第三组为直接共培养组;每组设3个复孔,37℃、5% CO2细胞孵箱条件下共培养72h。3.1间接共培养用到的Tanswell小室孔径大小为0.4um,膜为聚碳酸酯膜,保证细胞之间不直接接触,但可以进行信息的双向交流。作用细胞200ul置于上室,主体细胞L428为1000ul置于24孔板中即下室,两者细胞数量比值为1:10,细胞密度比值为1:2,即作用细胞密度为105/ml,L428密度为2×105/ml,培养基均为10%血清浓度的RPMI-1640。向小室加细胞悬液时动作要适度,以免产生气泡,否则影响膜的通透性。3.2直接共培养作用细胞常规孵箱培养72h后,调整细胞密度为2×105/ml的状态下收集上清,与血清1:1稀释;密度为2×105/ml的L428,833ul置于24孔板中,另加167ul上述已经稀释好的作用上清,常规培养孵箱条件下72h。4.生物学活性相关指标的检测从不同角度来研究L428的增殖。荧光定量Notchl的表达是从mRNA水平来检测其含量,是溯源判定;细胞周期是从DNA含量及所处时相来判定细胞的增殖快慢,是过程判定;MTT代表所测样品活细胞数目,是结果判定;三者结合起来可以取长补短,更好地反映L428的增殖。5. PBMC的制备制备20ml新鲜的抗凝外周血,与等体积的PBS混合均匀后,每次加20ml混合后的外周血于盛有相同体积分离液表面。此操作务必小心,保持界面清晰。300g离心15min,此时分为4层,从上向下依次为:血清层、白膜层(目的PBMC)、分离液层、红细胞层;吸去血清层剩至5mm厚度时,小心吸取白膜层到新的离心管中,加PBS混匀后离心,重复两次;如果沉淀中混有红细胞可以加入适量红细胞裂解液,洗涤干净后吸至培养瓶中培养,2h后贴壁细胞贴壁,把细胞悬液吸至新的培养瓶中培养。6.淋巴结悬液的制备收集临床上正常的淋巴结组织,放至小青霉素瓶中剪碎,200目滤网过滤,注射器活塞协助研磨以达到单细胞目的;用PBS洗涤过滤后的单细胞,若混有红细胞可酌量加红细胞裂解液;洗涤干净后吸至培养瓶中培养,2h后贴壁性质的细胞贴壁,把细胞悬液吸至新的培养瓶中进行培养。7.CD4+T细胞的趋化实验应用人的CD4免疫磁珠分选PBMC中的CD4+T细胞,利用L428相关的不同的条件培养基来检测其对CD4+T细胞的趋化效应。8统计学处理采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。HL两大类型背景细胞相关表型表达比值分析用两样本t检验;MTT法检测体外细胞增殖能力采用析因设计方差分析和单因素方差分析(One-way ANOVA); IPP6.0检测对应指标免疫组化表达强度比值、荧光定量检测Notch 1的表达、流式细胞仪检测细胞周期及趋化能力的分析均用One-way ANOVA比较组间差异;其中Levene检验方差齐性,方差齐性时Fisher方差分析而方差不齐时用Welch方差分析,若需进一步多重比较,方差齐性时采用LSD方法而方差不齐时用到Dunnett T3方法,以P<0.05为显著性差异。结果1.临床病理标本背景细胞相关表型表达分析收集的可用于全面研究的HL病例有37例,其中NLPHL有4例,CHL有33例;CHL各型中MCHL、NSHL、LRHL分别为6,14,13例。另有10例会诊病例仅可做T/B比值的分析,其中包括1例NLPHL,4例NSHL,5例LRHL。T/B比值统计学分析结果:两大类型比值为CHL高于NLPHL,两样本近似t检验结果显示差异具有显著性(t=-10.771,P=0.000);HL就比值整体而言为LRHL>NSHL>MCHL>NLPHL,Welch方差分析结果显示HL各型之间具有显著性差异(F=49.274,P=0.000), Dunnett T3多重比较显示NLPHL与MCHL间无显著差异(P=0.168), NLPHL与NSHL、LRHL有统计学差异(P值均为0.000),而CHL各型间没有统计学差异(P>0.05)。CD4/CD8比值统计学分析结果:两大类型整体比值为NLPHL高于CHL,t检验结果为两组间无显著差异(t=0.567,P=0.574);CHL中比值整体而言为MCHL>NSHL>LRHL,分析结果显示CHL各型之间具有显著性差异(F=4.511,P=0.019),进一步LSD多重比较结果为LRHL与MCHL、NSHL之间存在显著差异(P=0.011,P=0.030)。GrB/TIA-1比值统计学分析结果:两大类型整体比值为CHL高于NLPHL,t检验结果为两组间无显著差异(t=-0.168,P=0.868);CHL中比值整体而言为MCHL>NSHL>LRHL,CHL各型总体方差不齐(F=6.754,P=0.004), Welch方差分析显示CHL各型之间无显著性差异(F=4.584,P=0.075)。2.L428检测对L428形态学验证符合它大小细胞及核形态多样性的特点;CD30(+)、CD15(+),Mum-1(+),符合它独特的免疫表型标识。3.L428与CD4+Jurkat共培养荧光定量:Notchl表达量经单向方差分析显示总体表达量为直接组>间接组>单纯组,Levene检验方差齐性(F=3.410,P=0.103),基于方差齐性的Fisher方差分析各组间具有统计学差异(F=254.849,P=0.000),进一步用LSD多重比较结果为各组间均有显著性差异(P=0.000)。细胞周期:我们关注的指标是生长分数(S期+G2/M期),数值越大表明增殖越快。总体生长分数数值大小关系为直接组>间接组>单纯组,Levene检验方差齐性(F=0.417,P=0.677),基于方差齐性的Fisher方差分析显示差异具有统计学意义(F=177.817,P=0.000),进一步LSD多重比较结果显示两两之间差异具有统计学意义(P=0.000)。MTT:析因设计方差分析显示总体值大小关系为直接组>间接组>单纯组,组间时间两因素交互效应差异显著(F=58.678,P=0.000);时间主效应差异具有显著性(F=9047.268,P=0.000);组间主效应差异显著(F=420.007,P=0.000)。4.L428与含CD4+T的混合细胞共培养荧光定量:与LN共培养前后L428细胞Notchl表达量统计分析显示整体表达量大小为直接组>间接组>单纯组,Levene检验方差齐性(F=0.768,P=0.505),基于方差齐性的Fisher方差分析各组间具有统计学差异(F=23.094,P=0.002),进一步用LSD多重比较结果为各组间均有显著性差异(P<0.05);与PBMC共培养前后L428细胞Notchl表达量经单向方差分析结果为Levene检验方差齐性(F=0.186,P=0.835),基于方差齐性的Fisher方差分析各组间具有统计学差异(F=91.474,P=0.000),LSD多重比较显示两两之间均有统计学差异(P<0.05)。细胞周期:我们关注的指标是生长分数(S期+G2/M期),数值越大表明增殖越快。与LN细胞共培养结果显示生长分数数值关系为直接组>间接组>单纯组,Levene检验方差齐性(F=0.975,P=0.430),基于方差齐性的Fisher方差分析显示差异具有统计学意义(F=40.235,P=0.000),LSD多重比较结果显示两两之间差异具有统计学意义(P<0.05);与PBMC细胞共培养结果显示生长分数数值大小关系为直接组>间接组>单纯组,Levene检验方差齐性(F=2.218,P=0.190),基于方差齐性基础上Fisher方差分析显示差异具有统计学意义(F=37.272,P=0.000),LSD多重比较结果显示两两之间差异具有统计学意义(P<0.05)。MTT:整体效应是直接组>间接组>单纯组,与LN共培养结果显示组间时间两因素交互效应差异显著(F=13.57,P=0.000),时间主效应差异具有显著性(F=3598.391,P=0.000),组间主效应差异显著(F=145.723,P=0.000),每组细胞随时间的延长其增殖差异具有显著性;与PBMC共培养前后细胞体外增殖能力经析因设计的方差分析结果显示组间时间两因素交互效应差异显著(F=12.187,P=0.000),时间主效应差异具有显著性(F=2876.748,P=0.000),组间主效应差异显著(F=124.226,P=0.000),每组细胞随时间的延长其增殖差异具有显著性。5.不同条件培养基下的趋化性比较分离得到的CD4+T细胞用于趋化实验,结果显示普通培养基作为对照时仅有少量的细胞穿过,当趋化因子是CM和CM-CCL5时穿过的细胞依次增多,而当加入anti-CCL5的CM时则骤减,且有统计学意义(F=108.591,P=0.000),LSD多重比较显示两两之间均有显著性差异(P<0.05)。结论1.CHL和作为对照的NLPHL背景细胞分别以T细胞和B细胞占主导,在T亚型的分布上,二者都是以TIA-1和CD4阳性细胞为主;2.与CD4+T淋巴细胞株Jurkat共培养后的L428增殖能力显著增强;3.包含CD4+T细胞的LN和PBMC混合细胞共培养对L428均有显著的促生长增殖作用,但效应弱于Jurkat细胞;4.共培养总体效应为直接共培养效果好于间接共培养;5.L428分泌的细胞因子CCL5对CD4+T有显著的趋化效应。CHL瘤细胞与微环境相互影响、相互选择,最终形成了有利于HRS细胞生存的环境。创新之处1运用临床病理标本开展了CHL背景细胞T相关蛋白表达的半定量分析;2在细胞水平模拟了CHL微环境体系。

全文目录


摘要  3-12
ABSTRACT  12-23
前言  23-32
  1. 病理学特点  23-24
  2. 瘤细胞来源  24
  3. 流行病学  24
  4. HL微环境  24-26
  5. 背景淋巴细胞与HL预后  26-28
  6. 课题设想与目标  28
  参考文献  28-32
技术路线  32-34
第一章 HL临床病理标本的背景T细胞相关免疫表型分析  34-44
  一、材料与方法  34-36
  二、结果  36-39
  三、讨论  39-42
  参考文献  42-44
第二章 CD4~+T淋巴细胞对L428增殖的影响  44-65
  一、材料与方法  44-52
  二、结果  52-60
  三、讨论  60-63
  参考文献  63-65
第三章 含CD4~+T细胞的混合细胞对L428增殖的影响  65-78
  一、材料与方法  65-68
  二、结果  68-74
  三、讨论  74-75
  参考文献  75-78
第四章 L428对CD4~+T细胞的趋化效应  78-86
  一、材料与方法  78-81
  二、结果  81-83
  三、讨论  83-84
  参考文献  84-86
全文小结  86-87
英文缩写与注解  87-88
硕士期间发表论文  88-89
致谢  89-91
统计学证明  91

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 网状内皮系统肿瘤
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