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农杆菌介导人胰岛素基因BCA转化银耳研究

作　者: 郭益童
导　师: 谢宝贵
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 银耳芽孢紫外线诱变农杆菌介导转化人胰岛素基因
分类号: S567.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 27次
引　用: 2次
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内容摘要

以银耳Tr21为出发菌株,采用紫外线诱变方法处理对数生长期银耳芽孢,挑取12180个菌落,经过两轮筛选后得到5个对潮霉素敏感的菌株,在传代培养10代后,除一个菌株恢复对潮霉素抗性外,另外4个菌株保持突变性状,稳定遗传。通过冻融法将含有人胰岛素BCA基因及潮霉素磷酸转移酶hph基因的质粒pCB-BCA和pBHg-BCA分别单独转到根癌农杆菌EHA105和GV3101中。在质粒pCB-BCA中,目的基因及筛选标记基因前端所带启动子为花椰菜病毒35S启动子(P35S),pBHg-BCA所带启动子为双孢蘑菇gpd启动子。用以上携带不同质粒的农杆菌与银耳芽孢共培养后,在含有潮霉素的选择培养基上筛选转化子,只有携带质粒pBHg-BCA的农杆菌EHA105侵染银耳芽孢后得到抗性菌落,说明银耳可以识别双孢蘑菇gpd启动子,并且不同农杆菌介导转化存在宿主特异性。农杆菌介导转化,其转化效率受到多种因素影响。本试验通过设置农杆菌与银耳芽孢不同共培养时间、诱导剂乙酰丁香酮的浓度、银耳芽孢及农杆菌浓度等因素对转化效率影响,结果在乙酰丁香酮浓度为500μmol/mL、银耳芽孢浓度为108个/mL、农杆菌OD=0.5及共培养时间为2d时,转化效率最高,为310个转化子/108个银耳芽孢。随机挑选5个抗性菌落进行验证,PCR检测结果表明,人胰岛素基因已经整合到银耳基因组中;RT-PCR结果显示,在银耳细胞中可以检测到人胰岛素基因的mRNA;Southern杂交结果表明人胰岛素基因以单拷贝的形式整合到银耳基因组DNA中。转化子转接5代后对潮霉素仍有抗性,说明外源基因在银耳芽孢中能够稳定遗传。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
第一章前言  11-22
  1 银耳研究历史  11-12
  2 微生物诱变技术发展  12-15
    2.1 物理诱变方法  12-14
      2.1.1 紫外线诱变  12
      2.1.2 激光诱变  12-13
      2.1.3 离子束注入诱变  13
      2.1.4 微波诱变  13-14
      2.1.5 电离辐射诱变  14
    2.2 化学诱变  14-15
  3 食用菌转化方法研究  15-18
    3.1 PEG 介导转化  15-16
    3.2 限制性内切酶介导整合法(REMI)  16
    3.3 基因枪法  16-17
    3.4 电击法  17
    3.5 农杆菌介导转化  17-18
  4 银耳遗传转化体系研究  18
  5 基因重组人胰岛素研究进展  18-21
    5.1 在大肠杆菌中表达  19
    5.2 在酵母菌中表达  19-20
    5.3 在转基因植物中表达  20
    5.4 在转基因动物中表达  20-21
  6 本研究的目的和意义  21-22
第二章紫外诱变筛选银耳菌株  22-27
  1 材料与方法  22-23
    1.1 材料  22
      1.1.1 供试菌株  22
      1.1.2 培养基  22
      1.1.3 试剂  22
      1.1.4 仪器设备  22
    1.2 方法  22-23
      1.2.1 紫外线诱变  22-23
      1.2.2 对潮霉素敏感菌株筛选  23
  2 结果与分析  23-26
    2.1 不同照射时间对致死率影响  23-24
    2.2 初筛  24-25
    2.3 复筛  25-26
  3 讨论  26-27
第三章农杆菌介导法转化银耳芽孢  27-36
  1 材料与方法  27-32
    1.1 材料  27-29
      1.1.1 供试菌株及质粒  27
      1.1.2 培养基  27-28
      1.1.3 引物  28
      1.1.4 碱裂解法提质粒溶液  28-29
      1.1.5 电泳缓冲液  29
      1.1.6 试剂  29
      1.1.7 仪器设备  29
    1.2 方法  29-32
      1.2.1 碱裂解法提取质粒  29-30
      1.2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备  30
      1.2.3 冻融法转化农杆菌  30
      1.2.4 农杆菌菌落PCR  30-31
      1.2.5 农杆菌介导外源基因转化银耳芽孢  31-32
  2 结果与分析  32-35
    2.1 质粒转化农杆菌  32
    2.2 农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳 Tr21-01  32-35
  3 讨论  35-36
第四章农杆菌介导转化条件优化  36-42
  1 材料与方法  36-37
    1.1 材料  36
      1.1.1 供试菌株及质粒  36
      1.1.2 培养基  36
      1.1.3 试剂  36
    1.2 方法  36-37
      1.2.1 共培养时间  36-37
      1.2.2 乙酰丁香酮浓度  37
      1.2.3 银耳芽孢浓度  37
      1.2.4 农杆菌浓度  37
      1.2.5 银耳芽孢不同处理  37
  2 结果与分析  37-41
    2.1 共培养时间  37-38
    2.2 AS 浓度  38-39
    2.3 银耳芽孢浓度  39-40
    2.4 农杆菌浓度  40
    2.5 银耳芽孢不同处理  40-41
  3 讨论  41-42
第五章转化子验证  42-56
  1 材料与方法  42-49
    1.1 材料  42-44
      1.1.1 供试菌株及质粒  42
      1.1.2 培养基  42
      1.1.3 CTAB 法提DNA 试剂  42-43
      1.1.4 Southern blot 缓冲液  43
      1.1.5 引物  43
      1.1.6 试剂  43-44
    1.2 方法  44-49
      1.2.1 潮霉素抗性验证  44
      1.2.2 CTAB 法提取基因组DNA  44-45
      1.2.3 基因组DNA PCR 分析  45
      1.2.4 RT-PCR  45-47
      1.2.5 Southern 杂交  47-49
  2 结果与分析  49-54
    2.1 拟转化子涂布SM 平板  49-51
    2.2 转化子PCR 分析  51-52
      2.2.1 ITS 检测  51
      2.2.2 hph 基因  51-52
      2.2.3 人胰岛素基因BCA  52
    2.3 RT-PCR  52-53
    2.4 Southern 杂交  53-54
  3 讨论  54-56
总结  56-57
缩略词  57-58
附录1 质粒图谱  58-59
附录2 启动子及基因序列  59-61
参考文献  61-67
致谢  67

农杆菌介导人胰岛素基因BCA转化银耳研究

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