学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
农杆菌介导人胰岛素基因BCA转化银耳研究
作 者: 郭益童
导 师: 谢宝贵
学 校: 福建农林大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 银耳芽孢 紫外线诱变 农杆菌介导转化 人胰岛素基因
分类号: S567.34
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 27次
引 用: 2次
阅 读: 论文下载
内容摘要
以银耳Tr21为出发菌株,采用紫外线诱变方法处理对数生长期银耳芽孢,挑取12180个菌落,经过两轮筛选后得到5个对潮霉素敏感的菌株,在传代培养10代后,除一个菌株恢复对潮霉素抗性外,另外4个菌株保持突变性状,稳定遗传。通过冻融法将含有人胰岛素BCA基因及潮霉素磷酸转移酶hph基因的质粒pCB-BCA和pBHg-BCA分别单独转到根癌农杆菌EHA105和GV3101中。在质粒pCB-BCA中,目的基因及筛选标记基因前端所带启动子为花椰菜病毒35S启动子(P35S),pBHg-BCA所带启动子为双孢蘑菇gpd启动子。用以上携带不同质粒的农杆菌与银耳芽孢共培养后,在含有潮霉素的选择培养基上筛选转化子,只有携带质粒pBHg-BCA的农杆菌EHA105侵染银耳芽孢后得到抗性菌落,说明银耳可以识别双孢蘑菇gpd启动子,并且不同农杆菌介导转化存在宿主特异性。农杆菌介导转化,其转化效率受到多种因素影响。本试验通过设置农杆菌与银耳芽孢不同共培养时间、诱导剂乙酰丁香酮的浓度、银耳芽孢及农杆菌浓度等因素对转化效率影响,结果在乙酰丁香酮浓度为500μmol/mL、银耳芽孢浓度为108个/mL、农杆菌OD=0.5及共培养时间为2d时,转化效率最高,为310个转化子/108个银耳芽孢。随机挑选5个抗性菌落进行验证,PCR检测结果表明,人胰岛素基因已经整合到银耳基因组中;RT-PCR结果显示,在银耳细胞中可以检测到人胰岛素基因的mRNA;Southern杂交结果表明人胰岛素基因以单拷贝的形式整合到银耳基因组DNA中。转化子转接5代后对潮霉素仍有抗性,说明外源基因在银耳芽孢中能够稳定遗传。
|
全文目录
摘要 8-9 Abstract 9-11 第一章 前言 11-22 1 银耳研究历史 11-12 2 微生物诱变技术发展 12-15 2.1 物理诱变方法 12-14 2.1.1 紫外线诱变 12 2.1.2 激光诱变 12-13 2.1.3 离子束注入诱变 13 2.1.4 微波诱变 13-14 2.1.5 电离辐射诱变 14 2.2 化学诱变 14-15 3 食用菌转化方法研究 15-18 3.1 PEG 介导转化 15-16 3.2 限制性内切酶介导整合法(REMI) 16 3.3 基因枪法 16-17 3.4 电击法 17 3.5 农杆菌介导转化 17-18 4 银耳遗传转化体系研究 18 5 基因重组人胰岛素研究进展 18-21 5.1 在大肠杆菌中表达 19 5.2 在酵母菌中表达 19-20 5.3 在转基因植物中表达 20 5.4 在转基因动物中表达 20-21 6 本研究的目的和意义 21-22 第二章 紫外诱变筛选银耳菌株 22-27 1 材料与方法 22-23 1.1 材料 22 1.1.1 供试菌株 22 1.1.2 培养基 22 1.1.3 试剂 22 1.1.4 仪器设备 22 1.2 方法 22-23 1.2.1 紫外线诱变 22-23 1.2.2 对潮霉素敏感菌株筛选 23 2 结果与分析 23-26 2.1 不同照射时间对致死率影响 23-24 2.2 初筛 24-25 2.3 复筛 25-26 3 讨论 26-27 第三章 农杆菌介导法转化银耳芽孢 27-36 1 材料与方法 27-32 1.1 材料 27-29 1.1.1 供试菌株及质粒 27 1.1.2 培养基 27-28 1.1.3 引物 28 1.1.4 碱裂解法提质粒溶液 28-29 1.1.5 电泳缓冲液 29 1.1.6 试剂 29 1.1.7 仪器设备 29 1.2 方法 29-32 1.2.1 碱裂解法提取质粒 29-30 1.2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备 30 1.2.3 冻融法转化农杆菌 30 1.2.4 农杆菌菌落PCR 30-31 1.2.5 农杆菌介导外源基因转化银耳芽孢 31-32 2 结果与分析 32-35 2.1 质粒转化农杆菌 32 2.2 农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳 Tr21-01 32-35 3 讨论 35-36 第四章 农杆菌介导转化条件优化 36-42 1 材料与方法 36-37 1.1 材料 36 1.1.1 供试菌株及质粒 36 1.1.2 培养基 36 1.1.3 试剂 36 1.2 方法 36-37 1.2.1 共培养时间 36-37 1.2.2 乙酰丁香酮浓度 37 1.2.3 银耳芽孢浓度 37 1.2.4 农杆菌浓度 37 1.2.5 银耳芽孢不同处理 37 2 结果与分析 37-41 2.1 共培养时间 37-38 2.2 AS 浓度 38-39 2.3 银耳芽孢浓度 39-40 2.4 农杆菌浓度 40 2.5 银耳芽孢不同处理 40-41 3 讨论 41-42 第五章 转化子验证 42-56 1 材料与方法 42-49 1.1 材料 42-44 1.1.1 供试菌株及质粒 42 1.1.2 培养基 42 1.1.3 CTAB 法提DNA 试剂 42-43 1.1.4 Southern blot 缓冲液 43 1.1.5 引物 43 1.1.6 试剂 43-44 1.2 方法 44-49 1.2.1 潮霉素抗性验证 44 1.2.2 CTAB 法提取基因组DNA 44-45 1.2.3 基因组DNA PCR 分析 45 1.2.4 RT-PCR 45-47 1.2.5 Southern 杂交 47-49 2 结果与分析 49-54 2.1 拟转化子涂布SM 平板 49-51 2.2 转化子PCR 分析 51-52 2.2.1 ITS 检测 51 2.2.2 hph 基因 51-52 2.2.3 人胰岛素基因BCA 52 2.3 RT-PCR 52-53 2.4 Southern 杂交 53-54 3 讨论 54-56 总结 56-57 缩略词 57-58 附录1 质粒图谱 58-59 附录2 启动子及基因序列 59-61 参考文献 61-67 致谢 67
|
相似论文
- 一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析,S435.654
- 水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建,S435.111.42
- 水稻OsELF3基因RNAi载体的构建及其转化研究,S511
- PKR基因表达载体构建及农杆菌介导玉米茎尖遗传转化,S513
- 中老年人群眼轴及相关眼球生物学指标与基因多态性间的关联分析,R778.11
- 紫外线诱变筛选黑木耳优良菌株及RAPD鉴定,S646.6
- 杨树遗传转化及超声波处理对插穗生根影响的研究,S792.11
- 根癌农杆菌介导深绿木霉(Trichoderma atroviride)T23转化体系的建立以及高效降解敌敌畏突变株筛选与应用研究,S481.8
- 餐饮废水高效降解蛋白菌株的分离筛选及诱变选育研究,X703
- 盾壳霉产孢相关基因的克隆及腺苷脱氨酶(CMADA)基因的初步研究,S476.1
- 三江白猪GH、IGF-Ⅰ基因多态性及与早期生长性能的关联分析,S828
- 不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物,S567.34
- 根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的研究,Q78
- 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化及脂肪酶基因表达的研究,Q78
- 农杆菌介导的高羊茅转化WAX2基因研究,S688.4
- 棉花GhManA2基因纤维特异表达启动子的克隆与功能初步分析,S562
- 北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性评价及GFP基因在病理学研究中的应用,S435.13
- 尾加压素Ⅱ基因多态性与广西汉族人群代谢综合征的相关性研究,R589
- 榆黄蘑高多糖含量菌株的筛选,S646
- 印记基因H19和IGF-ⅡmRNA在新生儿胎盘中的表达与出生体重的关系,R714.56
中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 药用作物 > 菌类 > 银耳
© 2012 www.xueweilunwen.com
|