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猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立及乙脑病毒四川分离株PrM/E基因的序列分析
作 者: 王伟杰
导 师: 文心田;曹三杰
学 校: 四川农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪乙型脑炎 RT-PCR PrM基因 基因型 E基因
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
乙型脑炎(简称乙脑)是一种经蚊媒传播的严重威胁人畜健康的急性传染病。猪是乙脑病毒的重要储存宿主和扩增宿主,乙脑带毒猪是该疫病的主要传染源。该病给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。本研究建立了猪乙脑病毒RT-PCR诊断方法并对分离自四川崇州猪场和内江猪场的蚊源乙脑病毒(CZ1株和NJ1株)进行PrM/E基因的序列分析,从分子水平上了解四川乙脑分离毒株的生物学特性,对JEV的诊断、预防和控制具有较大的意义。1.猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立参考GenBank中收录的31株JEV E基因序列,进行相似性分析,以SA14-14-2为参照确定1725-2163区段为扩增靶序列;用Primer 5软件合成了一对引物(P1/P2),产物长度为439bp。对试验的Mg2+浓度、引物浓度、退火温度等反应条件进行优化、选择。确定了PT-PCR扩增最佳体系为:10×buffer (Mg2+-Free) 5μL,25mM Mg2+ 2.0μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10pmol上下游引物各0.8μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL,DNA模板1μL,最后用无菌去离子水补至50μL。PCR扩增程序如下:94℃-5min;94℃-30S,56℃-30 S,72℃40 S,30个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。RT-PCR特异性检测试验表明,该方法对常见的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒扩增均无条带;敏感性检测显示,能最低检测到10pg的JEV核酸。结果表明建立了RT-PCR检测JEV方法,具有简单、快速、特异性好、灵敏性高等优点。2.四川乙脑分离株CZ1株、NJ1株PrM/E基因的序列分析采用RT-PCR扩增并克隆分离株的PrM/E区段序列,利用PrM(456-695位)区段序列与29株参考序列进行基因分型分析,并对E区段核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14-14-2的相应序列进行比对,分析CZ1株、NJ1株与SA14-14-2氨基酸的相似性及关键结构域的差异。结果表明,CZ1株PrM(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅰ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为90.9%和97.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有15个氨基酸存在差异;JEV-NJ1株PrM(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅲ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为99.6%和99.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有3个氨基酸存在差异;本研究初步确定了CZl株和NJ1株的部分分子特征,对乙脑的流行病学研究及其防治具有重要意义。
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全文目录
中文摘要 4-6 Abstract 6-11 文献综述 11-22 1 JEV的病原学特性 11-13 1.1 JEV的理化特性 11-12 1.2 JEV的培养特性 12-13 1.3 JEV的血凝性 13 2 JEV的分子生物学特性 13-15 2.1 JEV的基因组及编码蛋白 13-14 2.2 结构蛋白 14-15 2.3 非结构蛋白 15 3 JEV的诊断方法 15-20 3.1 JEV的分离鉴定 16 3.2 JEV的血清学诊断方法 16-18 3.3 JEV的分子生物学诊断方法 18-20 4 新型疫苗的研究 20-21 5 本研究的目的与意义 21-22 5.1 猪JEV RT-PCR检测方法的建立 21 5.2 JEV四川分离株PrM/E基因的序列分析 21-22 第一章 猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立 22-31 1 材料 22-23 1.1 毒株和细胞 22 1.2 试剂 22 1.3 实验仪器 22-23 2 方法 23-26 2.1 JEV引物设计 23 2.2 JEV病毒的增殖 23 2.3 JEV核酸提取 23-24 2.4 JEV CDNA的合成 24-25 2.5 JEV RT-PCR的扩增 25 2.6 JEV RT-PCR条件的优化 25-26 2.7 RT-PCR特异性试验 26 2.8 RT-PCR敏感性试验 26 2.9 临床样品的检测 26 3 结果 26-29 3.1 JEV RT-PCR扩增结果 26-27 3.2 RT-PCR扩增优化结果 27-28 3.3 RT-PCR特异性结果 28 3.4 RT-PCR敏感性结果 28-29 3.5 临床检测结果 29 4 讨论 29-31 4.1 扩增基因的选择 29 4.2 PCR的循环次数 29-30 4.3 JEV RT-PCR检测的敏感性 30 4.4 JEV RNA提取 30-31 第二章 JEV分离株CZ1、NJ1的PrM/E基因的克隆和序列分析 31-45 1 材料 31-32 1.1 生物材料 31 1.2 主要试剂 31 1.3 主要仪器 31-32 2 方法 32-36 2.1 引物设计 32 2.2 JEV核酸的提取及cDNA合成 32 2.3 JEV PrM/E基因的扩增 32-33 2.4 PCR产物的回收与纯化 33 2.5 JEV PrM/E基因的克隆 33-34 2.6 阳性菌落的筛选与鉴定 34-36 3 结果 36-42 3.1 PrM/E基因的扩增结果 36 3.2 重组质粒pMD19-T-PrM/E的鉴定 36-37 3.3 PrM/E基因的序列测定 37-38 3.4 新分离病毒E基因的相似性分析 38-39 3.5 E蛋白活性结构域氨基酸分析 39-40 3.6 四川省新分离2株JEV的基因分型 40-42 4 讨论 42-45 4.1 四川乙脑分离株遗传进化的特征 42-43 4.2 乙脑活载体疫苗研制中保护性基因的选择 43 4.3 乙脑病毒E蛋白相似性及活性结构域分析 43-45 结论 45-46 参考文献 46-53 附录 53-57 致谢 57
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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