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猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立及乙脑病毒四川分离株PrM/E基因的序列分析

作 者: 王伟杰
导 师: 文心田;曹三杰
学 校: 四川农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪乙型脑炎 RT-PCR PrM基因 基因型 E基因
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


乙型脑炎(简称乙脑)是一种经蚊媒传播的严重威胁人畜健康的急性传染病。猪是乙脑病毒的重要储存宿主和扩增宿主,乙脑带毒猪是该疫病的主要传染源。该病给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。本研究建立了猪乙脑病毒RT-PCR诊断方法并对分离自四川崇州猪场和内江猪场的蚊源乙脑病毒(CZ1株和NJ1株)进行PrM/E基因的序列分析,从分子水平上了解四川乙脑分离毒株的生物学特性,对JEV的诊断、预防和控制具有较大的意义。1.猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立参考GenBank中收录的31株JEV E基因序列,进行相似性分析,以SA14-14-2为参照确定1725-2163区段为扩增靶序列;用Primer 5软件合成了一对引物(P1/P2),产物长度为439bp。对试验的Mg2+浓度、引物浓度、退火温度等反应条件进行优化、选择。确定了PT-PCR扩增最佳体系为:10×buffer (Mg2+-Free) 5μL,25mM Mg2+ 2.0μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10pmol上下游引物各0.8μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL,DNA模板1μL,最后用无菌去离子水补至50μL。PCR扩增程序如下:94℃-5min;94℃-30S,56℃-30 S,72℃40 S,30个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。RT-PCR特异性检测试验表明,该方法对常见的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒扩增均无条带;敏感性检测显示,能最低检测到10pg的JEV核酸。结果表明建立了RT-PCR检测JEV方法,具有简单、快速、特异性好、灵敏性高等优点。2.四川乙脑分离株CZ1株、NJ1株PrM/E基因的序列分析采用RT-PCR扩增并克隆分离株的PrM/E区段序列,利用PrM(456-695位)区段序列与29株参考序列进行基因分型分析,并对E区段核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14-14-2的相应序列进行比对,分析CZ1株、NJ1株与SA14-14-2氨基酸的相似性及关键结构域的差异。结果表明,CZ1株PrM(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅰ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为90.9%和97.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有15个氨基酸存在差异;JEV-NJ1株PrM(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅲ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为99.6%和99.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有3个氨基酸存在差异;本研究初步确定了CZl株和NJ1株的部分分子特征,对乙脑的流行病学研究及其防治具有重要意义。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-11
文献综述  11-22
  1 JEV的病原学特性  11-13
    1.1 JEV的理化特性  11-12
    1.2 JEV的培养特性  12-13
    1.3 JEV的血凝性  13
  2 JEV的分子生物学特性  13-15
    2.1 JEV的基因组及编码蛋白  13-14
    2.2 结构蛋白  14-15
    2.3 非结构蛋白  15
  3 JEV的诊断方法  15-20
    3.1 JEV的分离鉴定  16
    3.2 JEV的血清学诊断方法  16-18
    3.3 JEV的分子生物学诊断方法  18-20
  4 新型疫苗的研究  20-21
  5 本研究的目的与意义  21-22
    5.1 猪JEV RT-PCR检测方法的建立  21
    5.2 JEV四川分离株PrM/E基因的序列分析  21-22
第一章 猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立  22-31
  1 材料  22-23
    1.1 毒株和细胞  22
    1.2 试剂  22
    1.3 实验仪器  22-23
  2 方法  23-26
    2.1 JEV引物设计  23
    2.2 JEV病毒的增殖  23
    2.3 JEV核酸提取  23-24
    2.4 JEV CDNA的合成  24-25
    2.5 JEV RT-PCR的扩增  25
    2.6 JEV RT-PCR条件的优化  25-26
    2.7 RT-PCR特异性试验  26
    2.8 RT-PCR敏感性试验  26
    2.9 临床样品的检测  26
  3 结果  26-29
    3.1 JEV RT-PCR扩增结果  26-27
    3.2 RT-PCR扩增优化结果  27-28
    3.3 RT-PCR特异性结果  28
    3.4 RT-PCR敏感性结果  28-29
    3.5 临床检测结果  29
  4 讨论  29-31
    4.1 扩增基因的选择  29
    4.2 PCR的循环次数  29-30
    4.3 JEV RT-PCR检测的敏感性  30
    4.4 JEV RNA提取  30-31
第二章 JEV分离株CZ1、NJ1的PrM/E基因的克隆和序列分析  31-45
  1 材料  31-32
    1.1 生物材料  31
    1.2 主要试剂  31
    1.3 主要仪器  31-32
  2 方法  32-36
    2.1 引物设计  32
    2.2 JEV核酸的提取及cDNA合成  32
    2.3 JEV PrM/E基因的扩增  32-33
    2.4 PCR产物的回收与纯化  33
    2.5 JEV PrM/E基因的克隆  33-34
    2.6 阳性菌落的筛选与鉴定  34-36
  3 结果  36-42
    3.1 PrM/E基因的扩增结果  36
    3.2 重组质粒pMD19-T-PrM/E的鉴定  36-37
    3.3 PrM/E基因的序列测定  37-38
    3.4 新分离病毒E基因的相似性分析  38-39
    3.5 E蛋白活性结构域氨基酸分析  39-40
    3.6 四川省新分离2株JEV的基因分型  40-42
  4 讨论  42-45
    4.1 四川乙脑分离株遗传进化的特征  42-43
    4.2 乙脑活载体疫苗研制中保护性基因的选择  43
    4.3 乙脑病毒E蛋白相似性及活性结构域分析  43-45
结论  45-46
参考文献  46-53
附录  53-57
致谢  57

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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