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调控巨噬细胞自噬对结核分支杆菌清除作用的影响

作　者: 谌朝
导　师: 潘频华
学　校: 中南大学
专　业: 临床医学
关键词: 原代巨噬细胞自噬结核杆菌H37Rv 清除 3-甲基腺嘌呤雷帕霉素 IFN-γ
分类号: R52
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的自噬(Autophagy)是广泛存在于真核细胞中的生命现象,是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器以及维持细胞稳态的共同机制,本实验旨在通过对鼠肺原代巨噬细胞和活体动物实验相结合的实验方法来说明三甲基腺嘌呤,雷帕霉素调控巨噬细胞自噬对结核杆菌清除作用的影响,以证明自噬作用在细胞内病原体清除中的地位。方法：分为体外实验和体内试验两部。第一部体外实验：通过灌洗健康大鼠肺部,得到原代巨噬细胞后将细胞分为四组：空白对照组,三甲基腺嘌呤组,雷帕霉素组,IFN-γ组(阳性对照组)。各组均用胎牛血清DMEM培基培养2天,再分别加入三甲基腺嘌呤60mg／L作用3小时；雷帕霉素50nmol/l作用36小时,IFN-γ400U作用3小时后再分别加入结核分枝杆菌H37Rv菌株1×10^7 CFU/L共培育3小时,用PBS pH7.4缓冲液冲洗3次以洗脱未结合的H37Rv菌株,将冲洗液做荧光定量PCR检测巨噬细胞吞噬后剩余结核分枝杆菌DNA浓度,以检测各组巨噬细胞清除结核杆菌的情况；第二部体内试验：将20只BALB/C小鼠(6周龄)随机分为四组,分别腹腔注射：3-甲基腺嘌呤雷帕霉素IFN-γ,空白组不注射后雾化感染结核杆菌。7w后脱颈椎处死,无菌条件下取肺组织分别做病理切片HE染色和抗酸染色,结核杆菌菌落计数以检测结核杆菌在活体内的清除情况。结果：1.荧光定量PCR法检测四组巨噬细胞吞噬后的结核杆菌,实时监控雷帕霉素组与IFN-γ组(阳性对照组)结核杆菌数量明显低于空白对照组和三甲基腺嘌呤组。比较雷帕霉素组与IFN-γ组(阳性对照组)分别和空白对照组,三甲基腺嘌呤组之间差异有统计学意义,空白对照组和三甲基腺嘌呤组之间差异也有统计学意义。2.肺组织病理切片两种染色结果均显示雷帕霉素组与IFN-γ组(阳性对照组)肺组织病理变化明显轻于空白组和三甲基腺嘌呤组。3.肺组织均浆液结核杆菌菌落计数显示雷帕霉素组和IFN-γ组(阳性对照组)菌落计数最少且雷帕霉素组与IFN-γ组(阳性对照组)分别和空白对照组,三甲基腺嘌呤组之间差异有统计学意义,空白对照组和三甲基腺嘌呤组之间差异也有统计学意义。结论1、三甲基腺嘌呤可下调巨噬细胞自噬作用对结核杆菌的清除,雷帕霉素可上调巨噬细胞自噬作用对结核杆菌的清除。2、验证了经过雷帕霉素上调的自噬作用对结核杆菌的清除效果与IFN-γ通过调节细胞免疫对结核杆菌的清除效果等同。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-11
缩略词  11-12
前言  12-15
第一章材料和方法  15-21
  1 实验材料  15-16
    1.1 实验细胞  15
    1.2 实验细胞干预药物  15
    1.3 实验试剂  15
    1.4 主要实验仪器  15-16
    1.5 实验试剂及用品处理方法  16
  2 实验方法  16-21
    2.1 体外实验  16-19
      2.1.1 大鼠肺泡巨噬细胞的提取和培养  16-17
      2.1.2 实验分组  17-18
      2.1.3 荧光定量PCR检测原代巨噬细胞对结核杆菌的清除  18-19
    2.2 体内试验  19-21
      2.2.1 结核杆菌感染小鼠  19-20
      2.2.2 小鼠肺组织病理切片和结核杆菌菌落计数  20
      2.2.3 统计分析  20-21
第二章结果  21-26
  2.1 体外实验原代巨噬细胞吞噬后结核杆菌测定  21-22
    2.1.1 实时荧光定量PCR检测一标准曲线图的建立  21-22
    2.1.2 各组样品中的结核杆菌定量结果  22
  2.2 体内试验  22-26
    2.2.1 各组实验小鼠肺组织HE染色观察组织病理改变  22-23
    2.2.2 各组实验小鼠肺组织抗酸染色  23-24
    2.2.3 结核杆菌菌落计数  24-26
第三章讨论  26-28
第四章结论  28-29
参考文献  29-33
综述  33-40
致谢  40

调控巨噬细胞自噬对结核分支杆菌清除作用的影响

内容摘要

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