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外源性NEP1-40对大鼠脊髓半切损伤后修复的影响

作　者: 边涛
导　师: 朱涛
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 脊髓损伤 Nogo-A 生物素化葡聚糖胺 NEP1-40 NF200
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

[目的]建立大鼠脊髓第10胸节右侧半横断损伤模型,应用髓磷脂相关抑制物Nogo-A的受体拮抗剂—外源性NEP1-40对大鼠进行损伤处置管注射,分析并评价NEP1-40在脊髓损伤后可能具有的利于神经轴突再生的作用,探讨其可能利于运动功能恢复的效果与机制；观察脊髓损伤后Nogo-A表达的变化并根据此变化探寻脊髓损伤后NEP1-40给药的最佳时间。[方法]1、利用自制的显微刀片切割损伤大鼠脊髓第10胸节右侧半,建立脊髓胸节半横断损伤模型。2、200-220g的健康雌性Wistar大鼠60只随机分为3组(n=20),①假手术组,仅去除椎板,不损伤脊髓,不埋管,不注射；②对照组,做脊髓第10胸节右侧半切损伤,术后第1天开始每天给予PBS 25μl,连续7天；③治疗组,做脊髓第10胸节右侧半切损伤,术后第1天开始每天给予NEP1-4015μg/PBS 25μl,连续7天。④各组均按处死时间再分别分为四个亚组,即：术后7天组、术后14天组、术后21天组和术后28天组,每亚组5只大鼠,用BBB评分法对大鼠行为学表现评分后,进行4%多聚甲醛液心脏灌注,取损伤部位脊髓标本,用HE染色和免疫组化染色法观察组织形态学变化。3、200-220g的健康雌性Wistar大鼠15只,分为假手术组、对照组和治疗组(n=5)。各组处理与给药方法同上。于脊髓半切损伤后2周,立体定向仪下,利用微量注射器行大脑感觉运动区BDA顺行示踪剂注射,并于注射BDA2周后取脊髓标本,快速冰冻后在荧光显微镜下观察脊髓损伤区附近的神经轴突走行情况。4、应用Image-Pro Plus 6,0图像分析系统对Nogo-A切片、NF200切片、BDA切片进行分析处理。采用t检验(student’s t-test)比较两组数据之间的差异性,用方差分析(analysis of variance, ANOVA)比较多组数据间的差异性,p<0.05即认为差异具有统计学意义,p<0.01即认为差异具有显著统计学意义。[结果]1、大鼠脊髓胸节半横断模型成功稳定,重复性好,损伤程度恒定,解剖定位准确,功能障碍亦确定。2、损伤前所有动物BBB评分均为21分,对照组和治疗组动物经脊髓半切损伤后均呈患侧下肢瘫痪,一天后开始逐渐恢复,随着时间的推移各组动物评分均逐渐增加,而且术后各个时间点评分治疗组均好于对照组(7d,P<0.05；14d、21d、28d,P<0.01)。假手术组动物各时间点BBB评分始终为21分。3、免疫组化染色观察：NF200：脊髓半切损伤后各个时间点观察显示,假手术组几乎未见明显NF200强阳染细胞；对照组与治疗组在临近脊髓损伤区的两侧灰质内可见明显阳染神经元及轴突,两组相比存在差异,治疗组阳染神经元数目较多(7d、14d,P<0.05；21d、28d,P<0.01)。Nogo-A:脊髓半切损伤后各个时间点观察显示,假手术组、对照组、治疗组均可见Nogo-A阳染的少突胶质细胞胞浆和髓鞘。临近脊髓损伤区的两侧白质内阳染区域IOD分析,伤后7天、14天治疗组和对照组均高于假手术组(7d,P<0.01；14d,对照组P<0.05,治疗组P<0.01)；但各个时间点,治疗组与对照组相比未见差异(P>0.05)。4、BDA皮质脊髓束神经纤维顺行示踪结果显示,假手术组脊髓神经纤维显色清晰、着色均匀,能够顺利通过第10胸节脊髓下行。对照组神经纤维几乎不能突破脊髓损伤段下行,治疗组可见少量神经纤维通过脊髓损伤段下行。5、相关性：BBB评分有随脊髓损伤邻近区NF200阳染神经细胞的数目增多而增加的趋势。统计分析结果,二者存在正相关(对照组r=0.925,P<0.01；治疗组r=0.937,P<0.01)。[结论]1、大鼠脊髓胸节半横断损伤模型可重复性高,一致性好；保留二便功能,并发症少,动物长期存活率高；适合进行脊髓损伤的基础性神经生物学研究。2、注射外源性NEP1-40具有利于大鼠脊髓损伤区神经轴突再生的作用,并通过对神经轴突再生的影响使脊髓损伤大鼠的下肢运动功能得到改善。3、Nogo-A作为脊髓损伤后最主要的髓磷脂相关抑制物,在损伤后早期表达量有明显增高趋势,这种表达量的变化决定了其受体拮抗剂NEP1-40的应用有时间依赖性,应在损伤后2周内应用,1周内开始应用为最佳。且NEP1-40的应用不会影响Nogo-A的表达变化,避免了可能潜在的副作用。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
缩略语/符号说明  11-12
前言  12-14
  研究现状、成果  12-13
  研究目的、方法  13-14
材料和方法  14-24
  1.1. 实验材料  14-15
    1.1.1. 实验动物  14
    1.1.2. 主要试剂  14-15
    1.1.3. 主要仪器  15
  1.2. 实验方法  15-24
    1.2.1 动物分组  15
    1.2.2 模型制作  15-18
    1.2.3. BBB评分  18-20
    1.2.4. 组织形态学观察方法  20-23
    1.2.5. 图像分析和统计处理  23-24
结果  24-38
  2.1. 一般表现和行学评价  24-25
  2.2. HE染色  25-28
  2.3. NF200免疫组织化学染色  28-31
  2.4. 相关分析  31-33
  2.5. Nogo-A免疫组织化学染色  33-35
  2.6. BDA神经纤维顺行示踪  35-38
讨论  38-46
  3.1. Nogo-A  38-41
    3.1.1. 结构  38-39
    3.1.2. 作用机制  39
    3.1.3. NEP1-40的发现  39-40
    3.1.4. Nogo-A的表达  40-41
  3.2. 脊髓损伤动物模型  41-42
  3.3. BDA皮质脊髓束神经纤维顺行示踪  42-43
  3.4. NF200  43-44
  3.5. 展望  44-46
结论  46-47
参考文献  47-51
发表论文和参加科研情况说明  51-52
综述  52-59
  Nogo蛋白与中枢神经系统损伤修复  52-57
  综述参考文献  57-59
致谢  59

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