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哈尔滨地区黑斑蛙（Rana nigromaculata）夏季皮肤抗菌肽多样性的研究

作　者: 李晓平
导　师: 徐艳春
学　校: 东北林业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 黑斑蛙 Rana nigromaculata 抗菌肽多样性适应性进化
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 34次
引　用: 1次
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内容摘要

抗菌肽具有广谱杀菌、抑制病毒、抑制肿瘤细胞等作用,是两栖类动物天然免疫的主要成分。不同的环境中,抗原组成不同,两栖类机体会选择性地表达不同的抗菌肽谱。因而抗原是抗菌肽进化的主要压力。动物体如何根据环境抗原来变化表达谱呢?目前关于这个问题尚无研究可鉴。针对这个问题,我们2009年6月份在哈尔滨市郊采集黑斑蛙(Rana nigromaculata)作为研究对象,一组在野外捕获后立即处死,采集皮肤样品,另一组在实验室内用清水饲养3周后再处死,采集皮肤样品。通过比较两种情况下抗菌肽谱的异同点,尤其是抗菌肽的种类、理化性质、选择模式等,来阐释不同环境下抗菌肽的表达模式。结果显示,黑斑蛙共表达10个家族的22种抗菌肽,由65个基因编码的71种cDNA组成。其中有7个家族的17种抗菌肽(62种cDNA,分属于esculentin-2家族、nigrocin-2家族、odorranoin-S1家族、temporin-1家族、pelophylaxin-2家族、odorranain-P1家族,odorranain-B1家族)是实验室组和野外组所共同表达的,而有2个家族的4种抗菌肽(8种cDNA分属brevinin-1家族和pelphylaxin-3家族)为野外组所特有,1个家族的1种抗菌肽(3种cDNA属于nigromaculatin家族)为实验室组所特有。两组共有的家族和野外组特有的家族中,都属于碱性抗菌肽,除了nigrocin-2家族和odorranoin-S1家族以自由卷曲结构为主以外,其余家族的抗菌肽均形成轴向和断面两个维度上具有两亲性的α-螺旋结构。实验室组特有的抗菌肽nigromaculatin家族属于自由卷曲的酸性抗菌肽。temporin-1家族的cDNA达22种,且总表达量最高,为较强烈的负选择抗菌肽,野外组表达量稍高于实验室组。esculentin-2家族的cDNA有16种,但总表达量不高,亦为负选择或近于中性选择的抗菌肽。pelphylaxin-3家族包含6种不同的cDNA,在野外组总表达量仅次于temporin-1家族,均为正选择抗菌肽。odorranain-B1家族、brevinin-1、nigromaculatin家族的表达量均很低,而且都属于负选择抗菌肽。统计表明,随着与祖先基因的遗传距离的增加,抗菌肽表现出从负选择逐渐过渡到正选择的倾向。上述结果提示,(1)黑斑蛙基因组上至少具有65个基因编码71种抗菌肽。(2)在不同环境中黑斑蛙抗菌肽表达谱中有稳定的组分和环境特异性组分。稳定组分中的抗菌肽基因比较古老而保守,环境特异性组分的抗菌肽基因通常出现较晚,且以正选择模式进化。(3)环境抗原较少时(如实验室组),抗菌肽的表达从种类和丰度上均明显减少,即抗菌肽的表达具有明显的经济性原则。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
1 绪论  8-16
  1.1 抗菌肽的结构特点  8-9
  1.2 抗菌肽的理化性质  9
  1.3 抗菌肽的作用机制  9-11
    1.3.1 抗菌肽对细菌的作用机制  9-10
    1.3.2 抗菌肽的对肿瘤细胞的作用机制  10-11
    1.3.3 抗菌肽对病毒的作用机制  11
  1.4 抗菌肽的基因结构与表达谱  11-13
  1.5 两栖类抗菌肽对于其生存和进化的作用  13-14
    1.5.1 抗菌肽对于两栖类的作用  13-14
    1.5.2 抗菌肽的进化方式  14
  1.6 本研究的目的和意义  14-16
2 材料与方法  16-21
  2.1 材料  16
  2.2 总RNA的提取  16
  2.3 黑板蛙皮肤抗菌肽cDNA的克隆  16-18
    2.3.1 引物的设计  16-17
    2.3.2 RT-PCR反应  17-18
  2.4 PCR产物的T-A克隆  18-20
    2.4.1 连接反应  18
    2.4.2 转化  18-19
    2.4.3 转化子的鉴定  19-20
  2.5 抗菌肽cDNA的测序及序列分析  20-21
3 结果  21-43
  3.1 总RNA的提取  21
  3.2 扩增结果  21-22
  3.3 黑斑蛙个体皮肤抗菌肽cDNA的克隆结果  22-32
    3.3.1 菌液检测结果  22
    3.3.2 本研究所获得的cDNA序列  22-23
    3.3.3 抗菌肽多样性及其理化性质预测  23-32
  3.4 各个家族的基因座位及其等位基因数  32
  3.5 各个家族抗菌肽序列的进化关系  32-34
  3.6 各个家族抗菌肽序列的选择模式  34-43
4 讨论  43-47
  4.1 抗菌肽表达谱与环境的关系  43-44
  4.2 黑斑蛙抗菌肽的进化  44-45
  4.3 一类酸性抗菌肽  45-47
5 结论  47-48
参考文献  48-51
攻读学位期间发表的学术论文  51-52
致谢  52-53

哈尔滨地区黑斑蛙（Rana nigromaculata）夏季皮肤抗菌肽多样性的研究

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