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黄芪根瘤内生菌次生代谢产物研究

作　者: 赵亮
导　师: 韦革宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 微生物
关键词: 黄芪 萃取相 最小抑菌浓度 系统发育树 麦角甾醇
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本实验采用薄层层析法、试管检测法,以来源于4个不同地区,6种不同寄主的17株黄芪根瘤内生菌为材料,首次对黄芪根瘤内生菌次生代谢产物化学成分做一初探。通过对每株供试菌发酵液的5个萃取相化学成分分析,发现其成分当中主要含有黄酮及其甙类、甾体及皂甙类、糖类及其甙类、氨基酸类、多肽及蛋白质,其次含有内酯香豆素、生物碱、有机酸、萜类、蒽醌类、酚性物质等成分,从而初步显示黄芪根瘤内生菌与寄主之间在次生代谢产物上具有一定的相关性。同时,为进一步研究其次生代谢产物的生物活性,本实验对每株供试菌株发酵液5个萃取相进行了抑菌活性的研究,其中抑制效果最为显著的氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相3个萃取相表明17株供试菌次生代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑制能力明显强于对大肠杆菌的抑制能力。为进一步研究其次生代谢物的抑菌活性,本实验选取其中5株抑制效果明显的菌株,测定其发酵液5个萃取相的MIC(最小抑菌浓度)和MBC(最小杀菌浓度)并进行进一步分析,结果表明:黄芪根瘤内生菌次生代谢产物中可能含有对革兰氏阳性细菌有明显抑制和致死作用的成分,而寄主为藏黄芪的根瘤内生菌次生代谢产物中主要含有这种成分,并且其成分属于化学极性偏大的成分。另外,本实验根据第二章所述实验结果筛选出在次生代谢产物多样性和抑菌活性水平上都具优势的一株菌BSD3-2。为确定其种属,并依据菌株BSD3-2次生代谢产物的研究结果,初步了解与此菌株种属关系相近菌种次生代谢产物的情况,本论文利用分子生物学手段,提取菌株BSD3-2的16SrDNA,并对其片段进行PCR扩增,而后利用Blast软件在GenBank等数据库中进行序列相似性比对,再用邻接法构建系统发育树,发现菌株BSD3-2与一参比菌株Ag. tumefaciens LMG196相似度高达100%,从而确定BSD3-2为土壤杆菌属根瘤内生菌。最后,为进一步对菌株BSD3-2次生代谢产物进行研究,本实验对其发酵液正丁醇浸膏进行了分离提取。通过大孔吸附树脂粗分离,反复硅胶柱层析细分离,从而得到单体化合物R和单体化合物M。对它们进行理化鉴定,核磁共振对其1H NMR和13C NMR谱图进行分析,借助飞行质谱MS确定其分子量,初步确定化合物R为某种长链烷烃类物质,且对金黄色葡萄球菌有抑制活性;确定化合物M为麦角甾醇,此化合物虽是已知化合物,但首次从根瘤内生菌中分离得到。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
第一章 文献综述  11-26
  1.1 植物内生菌的研究  12-18
    1.1.1 植物内生菌的起源、多样性、分布及其定植规律  12-13
    1.1.2 内生菌对植物的作用  13-14
      1.1.2.1 内生菌的固氮作用  13
      1.1.2.2 促植物生长作用  13-14
      1.1.2.3 增强宿主植物抗逆境、抗病虫害等作用  14
    1.1.3 药用植物内生菌次生代谢物的研究  14-15
      1.1.3.1 药用植物内生菌宿主的选择  14
      1.1.3.2 内生菌的筛选  14-15
    1.1.4 内生菌次生代谢活性物质  15-18
      1.1.4.1 内生菌与抗肿瘤活性物质  15
      1.1.4.2 内生菌与抗菌活性物质  15-16
      1.1.4.3 抗病毒活性化合物  16
      1.1.4.4 杀虫活性物质  16
      1.1.4.5 降血糖活性物质  16
      1.1.4.6 产激素类物质  16-17
      1.1.4.7 内生菌诱导子  17-18
      1.1.4.8 “基因水平传递”及“内共生理论”  18
  1.2 黄芪次生代谢产物的研究  18-23
    1.2.1 黄芪主要有效化学成分  19-21
      1.2.1.1 多糖成分  19
      1.2.1.2 黄酮类化合物  19-21
      1.2.1.3 皂甙类化合物  21
    1.2.2 黄芪的药理作用  21-23
      1.2.2.1 黄芪对免疫系统具有调节作用  21-22
      1.2.2.2 黄芪对蛋白质及核酸代谢的调节作用  22
      1.2.2.3 黄芪对心血管系统的作用  22
      1.2.2.4 黄芪的保肝作用  22-23
      1.2.2.5 抗癌作用  23
      1.2.2.6 抗衰老作用  23
  1.3 根瘤菌的研究  23-24
    1.3.1 根瘤菌的共生固氮作用  23-24
    1.3.2 根瘤菌次生代谢物的研究  24
  1.4 研究目的与意义  24-26
第二章 17 株黄芪根瘤内生菌次生代谢物化学成分及抑菌分析  26-37
  2.1 材料  26-27
    2.1.1 供试菌株  26
    2.1.2 试剂  26-27
      2.1.2.1 培养基  26-27
      2.1.2.2 化学试剂  27
    2.1.3 仪器  27
  2.2 方法  27-30
    2.2.1 菌株的活化  27
    2.2.2 发酵液的制备和次生代谢产物的提取  27
    2.2.3 化学成分分析  27-29
      2.2.3.1 试管法检测  27-28
      2.2.3.2 薄层层析显色  28-29
    2.2.4 抑菌活性的测定  29
      2.2.4.1 药液的制备  29
      2.2.4.2 菌悬液的制备  29
      2.2.4.3 含菌平板的制备  29
      2.2.4.4 加药剂  29
    2.2.5 二倍稀释法测定5 个萃取相的MIC 和MBC 值  29-30
      2.2.5.1 药液的制备  29
      2.2.5.2 菌液的制备  29-30
  2.3 结果与分析  30-35
    2.3.1 17 株根瘤内生菌各发酵萃取相化学成分检测结果  30-31
    2.3.2 抑菌初筛效果显著的5 株根瘤内生菌发酵液各萃取相的抑菌效果  31-34
    2.3.3 5 株根瘤内生菌发酵液对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的MIC 和MBC  34-35
  2.4 讨论  35-37
第三章 利用 16S rDNA 系统发育关系对菌株 BSD3-2 的鉴定  37-42
  3.1 材料与方法  37-38
    3.1.1 供试菌株  37
    3.1.2 参比菌株  37
    3.1.3 DNA 提取试剂  37
    3.1.4 PCR 扩增主要试剂  37-38
  3.2 方法  38-40
    3.2.1 DNA 的提取  38-39
    3.2.2 PCR 扩增  39-40
      3.2.2.1 PCR 引物  39
      3.2.2.2 PCR 反应体系  39
      3.2.2.3 PCR 扩增反应条件  39-40
      3.2.2.4 PCR 扩增产物的检测  40
    3.2.3 菌株BSD3-2 的分子鉴定  40
  3.3 结果与分析  40-41
  3.4 讨论  41-42
第四章 菌株BSD3-2 次生代谢产物的分离与提取  42-53
  4.1 材料  42
    4.1.1 材料  42
    4.1.2 试剂  42
    4.1.3 仪器  42
  4.2 方法  42-43
    4.2.1 分离纯化  42-43
      4.2.1.1 大孔吸附树脂预处理  42-43
      4.2.1.2 硅胶层析柱的制备  43
      4.2.1.3 单体R 与单体M 的分离纯化  43
    4.2.2 纯度检测  43
    4.2.3 结构解析  43
  4.3 结果与分析  43-51
    4.3.1 化合物R  43-47
      4.3.1.1 化合物R 的分离纯化  43-45
      4.3.1.2 化合物R 的纯度检测  45
      4.3.1.3 化合物R 的定性检测  45
      4.3.1.4 化合物R 的抑菌活性检测  45-46
      4.3.1.5 化合物R 的理化性质  46-47
    4.3.2 化合物M  47-49
      4.3.2.1 化合物M 的分离纯化  47-48
      4.3.2.2 化合物M 的纯度检测  48-49
      4.3.2.3 化合物M 的定性检测  49
      4.3.2.4 化合物M 的物理性质  49
    4.3.3 化合物M 的结构解析  49-51
      4.3.3.1 MS 解析  49-50
      4.3.3.2 13C-NMR 解析  50
      4.3.3.3 1H-NMR 解析  50-51
      4.3.3.4 化合物M 的结构确定  51
  4.4 讨论  51-53
第五章 总结  53-55
  5.1 17 株黄芪根瘤内生菌化学成分与抑菌分析  53
  5.2 利用16S rDNA 系统发育关系鉴定菌株BSD3-2  53-54
  5.3 菌株 BSD3-2 次生代谢产物的分离与提取  54-55
参考文献  55-61
附录  61-64
致谢  64-65
作者简介  65

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